常用分子标记技术原理及应用

常用分子标记原理与应用知识框架生化标记分子标记细胞学标记形态学标记遗传标记RFLPRAPDAFLPSSRISSRSNP常见分子标记什么是遗传标记（GeneticMarker）?遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的类型主要有四大类：1.形态标记(morphologicalmarker)2.细胞学标记(cytologicalmarker)3.生化标记(biochemicalmarker)4.分子标记(molecularmarker)主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点:形态学标记简单直观、经济方便。缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)多态性较差，表现易受环境影响;(3)有一些标记与不良性状连锁;(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。形态学标记形态标记（Morphologicalmarker）形态学上如何区分植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点:能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点:(1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大。(2)有些变异难以用细胞学方法进行检测。细胞学标记人类22对常染色体细胞分裂中期（Metaphase）•染色体组karyotype(Chromosomephenotype)analysis细胞学标记概念：主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。种类：可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）。同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但结构和生理性质不同的一类酶。生化标记的优点：数量更丰富，受环境影响更小。生化标记的缺点：蛋白质受生物体发育的时空影响很大。生化标记（BiochemicalMarker）主要内容：一、分子标记的相关概念及分类二、几种常见分子标记的原理及方法三、分子标记技术的应用分子标记技术分子标记来源于DNA水平的突变突变(Mutation)：是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。多态性(Polymorphism)：－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。1.广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。eg:蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）2.狭义的分子标记（DNAmarker)概念只是指DNA标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。一.分子标记相关概念分子标记的概念：是以直接检测DNA核苷酸序列的差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。分子标记（DNAmarker）分子标记的特点：(相对形态，细胞，生化标记具有的优点)（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类：是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；第二类：是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记；第三类：是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。分子标记的分类英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentIengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymor-phicDNA随机扩增多态性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SNPSimplemucleotidepolymor-phism单核苷酸多态性几种主要的ＤＮＡ分子标记1.RFLP2.RAPD3.AFLP()4.SSR5.ISSR()6.SNP二、几种常见分子标记的原理及方法AFLP—扩增片段长度多态性标记(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)起源：1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。定义:由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。核心技术：AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。AFLP的原理PrincipleofAFLP基本原理：对基因组DNA用两种限制性内切酶进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在3’端添加1-2个随机碱基对酶切连接后的DNA进行选择性扩增。此后再进行第二次PCR扩增，所用的引物是在第一次PCR中使用的选择性引物的3’端又附加了1-3个随机碱基。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。多态性源自限制性酶切位点的变异。AFLP的实验操作ProceduresforAFLPAFLP技术主要包括模板DNA制备、引物设计、酶切片段扩增及凝胶电泳分析4个步骤。各步骤具体的过程有：1.DNA模板酶切和接头连接（EcoRI/MseI）2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。3.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。基本步骤AFLPDNA提取两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析AFLP技术路线1.基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；2.接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。4.选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。AFLP的原理PrincipleofAFLPDNA提取两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优点1、具有分辨率高2、稳定性好3、效率高的优点AFLP特点1、试验成本高2、对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高缺点：优点：SimpleSequenceRepeat基本原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—10bp之间，常见的微卫星如TGTG……TG=(TG)n或AATAAT……AAT=(AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。SSR分子基础SSR基本步骤SSRDNA酶切收集酶切片段连接载体合成末端标记的SSR探针筛选含SSR的阳性克隆用于测序根据测序结果设计引物进行PCR扩增SSR优点:数量丰富，广泛分布于整个基因共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子实验重复性好，结果可靠所需DNA量少，对DNA质量要求不高缺点：由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，对于许多物种需构建文库，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSRInterSimpleSequenceRepeatbyZietkiewiczetal.(1994)基本原理：在SSR的5’或3’端加锚l～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。在SSR的3’端或5’端锚定1-4个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了SSR在基因组上的滑动大大提高了PCR扩增的专一性。ISSR分子基础ISSR银杏5个群体66个个体进行扩增的13种有效ISSR引物的特点ISSR图引物UBC845扩增ＴＭ群体15棵植株基因组DNA的ISSR电泳图ISSR