实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定

院系：理学院专业：农药学学号：09310110020姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定1实验目的本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。2实验原理研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4Tris-HCl缓冲液3mL，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。3实验材料3.1实验动物大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）3.2实验器材与试剂器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等试剂：1.17%KCl溶液Tris-HCl缓冲液：Tris6.05g；蔗糖68.4g；水500ml；浓盐酸调pH7.4；补水至1000ml4.实验方法4.1动物处理与匀浆制备断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17%KCl溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）的匀浆。4.2制备线粒体后上清液将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液即为线粒体后上清液。温度为0～4℃；离心力10000～12500g；时间15～30min4.3制备微粒体-超速离心法取线粒体后上清液8～12mL，置超离心管；离心100000g60min，弃上清液；微粒体板用0.25mol/L蔗糖液或1.17％KCl液洗1次，以除去污染的血红蛋白再离心100000g30～60min，弃上清液；微粒体板沉淀物移至离心管，加适量pH7.4Tris-HCl缓冲液重悬，终产物为微粒体悬液制备的肝微粒体每1g含蛋白一般在20mg左右；最好当天使用。若保存，应加20％（V/V）甘油分装于塑料管，置-20~-80℃，可保存数周而酶活性不减。4.4微粒体蛋白浓度测定1.微量法制定标准曲线取8个1.5ml离心管，分别编号0-7，按下表配制浓度梯度标准蛋白溶液。表1浓度梯度标准蛋白溶液样品编号01234567标准蛋白溶液(L)02550100200300400500Tris-HCl缓冲液(L)1000975950900800700600500标准蛋白浓度（mg/ml）00.0250.0500.10.20.30.40.5考马斯亮蓝试剂(L)200取上述各浓度蛋白标准稀释液20L与考马斯亮蓝染色剂200L至96孔酶标板内，各设三个重复孔，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于595nm处比色测定各孔OD值。以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，分别取肝微粒体悬液100倍和200倍稀释液20L，测定OD595nm值，平行测定三次。根据所测定的平均OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。4.5细胞色素P-450含量测定取蛋白含量已知的组织样品用pH7.40.1mol/LTris缓冲液(1.21gTris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至100ml稀释为每1mL含10mg微粒体蛋白的悬液；取此液0.3mL，加上述缓冲液5.7mL，混合；分装于2个比色杯（大约3mL），一个作为样品杯，另一个作为参比杯，置双光束紫外分光光度计，扫描400和500nm间的基线；加数mg连二亚硫酸钠，搅拌，样品杯轻轻充CO约1min，再扫描400～500nm的差示光谱。4.6结果计算P-450含量＝△OD（450-490）×1000/91×蛋白浓度C×r（mg/ml）×稀释倍数（nmol/mgPr）ΔOD为450nm处光密度值与490nm光密度值之差91为CYP450的消光系数，单位：cm2／mmolr为比色杯光径长度，单位：cmC为微粒体制备物的蛋白浓度，单位：mg／ml5.实验结果5.1标准曲线的绘制Bradford法测定标准蛋白结果和标准曲线见表2和图1表2标准蛋白595nm的OD值标准蛋白浓度（mg/mL）0.0250.0500.1000.2000.3000.4000.500吸光度A0.3990.4770.5610.6840.7630.8360.882以表2的数据绘制标准曲线如下。图1标准曲线y=0.984x+0.43600.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.10.20.30.40.50.6标准蛋白浓度（mg/mL)吸光度A5.2．未知样品蛋白质浓度的测定结果表3未知样品蛋白质浓度595nm的OD值溶液测定校正值校正均值稀释100倍0.9420.9510.9510.9671.0130.9760.970稀释200倍0.8070.8090.8080.8140.7930.8240.841根据所测定的平均OD595nm校正值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，计算出稀释100倍和200倍的蛋白浓度分别为53.96mg/ml，76.83mg/ml。因此，未知样品的蛋白浓度:65.40mg/ml5.3细胞色素P-450含量测定由于实验过程中未充入CO，因而未能测定细胞色素P-450,但是在420nm波长下测得细胞色素B5的差值光谱。图2双光束紫外分光光度计测得细胞色素B5的差示光谱（0.5mg/ml）Wavelength(nm)400410420430440450460470480Absorbance(AU)-0.02-0.0100.010.020.030.04427409OD值峰值（424nm）：0.0197；谷值（490nm）：0.00547。6实验讨论肝微粒体是肝细胞中内质网的亚细胞组分，含有丰富的药物代谢酶：其中细胞色素P450酶广泛的参与了各种物质的生物合成和代谢；肝S9是肝匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶。因此，微粒体是非常有价值的研究药物代谢和药物相互作用的工具。实验注意：操作的全过程及所用器械、人；溶液均应维持在0℃～4℃范围内，匀浆器始终应浸在冰水浴中，以避免肝微粒体酶因热变性而失活。制备无菌微粒体，需对所使用的全部器材和溶液进行灭菌处理。细胞色素P-450含量依组织、动物是否诱导、种属、品种等而定，一般未诱导的大、小鼠肝细胞色素P-450含量为0.4～1.0nmol/mg微粒体蛋白。为避免血红蛋白破坏，保险粉加入不宜过多。在缓冲液中加20％甘油可减少转化为无活性的细胞色素P-420，一般测定不需加甘油。样品与保险粉混合后应尽快充CO，因细胞色素P-450的还原形式不太稳定；充CO时速度宜慢，以免泡沫太多导致蛋白变性。充CO后如果420nm处吸收峰比较明显，表明有失活的细胞色素P-450，样品不能使用。本次试验中，在测定蛋白浓度的时候，由于考马斯亮蓝试剂保存时间太长，使得测定的蛋白浓度不准确；在测定P-450含量时，由于外部原因并没有充入CO，因而分光光度计在450nm处并没有出现峰值，而是在424nm处出现峰值，经查是细胞色素B5的峰值。细胞色素B5也存在于肝微粒体中，还原型b5与氰感受因子的酶一起，参与由氧将饱和酰基辅酶A转变成不饱和酰基辅酶A的脂肪酸不饱和化反应。通过测定一系列蛋白浓度浓度的差示光谱，确定了当蛋白浓度为0.5mg/ml时的光谱图效果比较好，该谱在紫外区的吸收杂峰不很明显，并且有着很明显的波峰和波谷，效果理想。