PCR实验室7500SOP

分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第1页，共4页【】ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111.目的：确保ABI7500仪器的正确使用及正常运行2.适用范围：美国应用生物系统公司生产的ABI7500实时荧光定量PCR仪3.运行环境：电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。通风：仪器的通风应该没有阻挡。温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10～30℃之间。湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。4.操作程序：4.1开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。4.2创建绝对定量反应板文件：4.2.1依次选择StartProgramsAppliedBiosystems7500AppliedBiosystems7500SDSSoftware()，以启动SDS软件;或在桌面双击AppliedBiosystems7500SDSSoftware()图标。4.2.2选择File（文件）New（新建）。4.2.3在NewDocumentWizard（新建文件向导）窗口中，从Assay（实验）下拉列表中选择AbsoluteQuantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线）。接受Container（反应板类型）和Template（模板）字段中的默认设置（即分别为96-WellClear（空白96孔板）和BlankDocument（空白反应板））。4.2.4在DefaultPlateName（默认反应板名）字段中输入反应板文件名，或接受默认文件名。4.2.5单击Next（下一步）。4.2.6选择要添加到反应板文件的探针。A）单击以选择一个探针。（按住Ctrl键单击可选择多个探针。）如果在DetectorManager（探针管理器）列表中未列出探针，请创建探针。B）单击Add（添加）。探针即被添加到反应板文件。C）单击Next（下一步）。4.2.7为每个反应孔指定探针和任务。A）单击一个反应孔（或对于重复选择一组反应孔）以选取它（们）。B）单击探针名，为反应孔选定探针。C）单击Task（任务）栏的下边，以指定探针任务。D）为包含标准样本的反应孔输入量值。E）单击Use（使用）。所选反应孔中显示探针任务和颜色。F）单击Finish（完成）。SDS软件即创建反应板文件。分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第2页，共4页4.2.8输入样本名。A）单击或选择View（视图）WellInspector（反应孔设定）。B）单击一个反应孔或拖动鼠标选取多个重复反应孔。C）输入样本名。D）如果必要，更改PassiveReference（阳性参比荧光）设置。（默认情况下，选择ROX™荧光。）E）重复步骤b至d，直到您为反应板上的所有反应孔均指定好样本名和阳性参比荧光。4.2.9在Setup（设定）选项卡上，检查并核对每个反应孔的信息。4.3设置热循环条件并开始运行反应板4.3.1选择Instrument（仪器）选项卡。默认情况下，显示两步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法中PCR步骤的标准PCR条件。4.3.2验证以下各项：A）如果您使用两步法RT-PCR–则已设置默认的PCR热循环条件。B）如果您使用“中山大学达安基因股份有限公司”的试剂–请按以下循环条件设置：93℃2分钟→1个循环；93℃45秒→55℃60秒→40个循环。C）SampleVolume（样本体积）为50µL。D）9600Emulation选项选取。4.3.3选择File（文件）SaveAs（另存为），为绝对定量反应板文件输入一个文件名，然后单击Save（保存）。4.3.4将反应板装入仪器中。4.3.5单击Start（开始）。在仪器运行PCR程序期间，Instrument（仪器）选项卡上会显示实时状态信息，并报告荧光信号强度。程序运行结束后，状态值和按钮变为灰色，而且Analysis（分析）按钮()变为可用状态，并显示信息提示您程序是否成功运行。程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤4.3.3中指定的绝对定量反应板文件中。4.4设置分析参数4.4.1选择AmplificationPlot（扩增图谱）选项卡，然后从Data（数据）下拉列表中选择DeltaRnvsCycle（∆Rn随循环变化）。4.4.2选择要在图谱上显示的反应孔。（如果不作选择，图谱将显示为空白。）4.4.3从Detector（探针）下拉列表中，选择一个探针。SDS软件显示所选探针和反应孔的图谱。4.4.4为探针设置基线。1）在AnalysisSettings（分析设置）下边，选择ManualBaseline（手动设置基线）。2）在Start(cycle)（开始循环）和End(cycle)（结束循环）字段中输入相应的值，确保扩增曲线的增长从EndCycle（结束循环）值之后的循环处开始。4.4.5为探针设置阈值。1）在AnalysisSettings（分析设置）下边，选择ManualCt（手动Ct）。2）用鼠标拖动阈值设置条，直到阈值位于：•背景的上边分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第3页，共4页•扩增曲线的平台期和线性增长期的下边•扩增曲线的指数增长期之内SDS软件调整阈值，并于分析之后在Threshold（阈值）字段中显示此值。4.4.6重复步骤4.4.3至4.4.4，为实验分析中的所有剩余探针设置适当的基线和阈值。4.4.7单击Analysis（分析）Analyze（执行分析），以使用调整后的基线和阈值设置重新分析数据。4.5分析并查看绝对定量数据4.5.1Plate（反应板）选项卡：显示每个反应孔的结果数据，包括：•每个反应孔的样本名、探针任务和颜色。•计算值-量值（默认值）、∆Rn或Ct。选择Analysis（分析）Display（显示）以选择要显示的值。4.5.2Spectra（光谱）选项卡：显示所选反应孔的荧光光谱。•用鼠标指针点击并拖动Cycle（循环）滑块上的指示器，可查看每一循环的光谱。•Cycle#（循环次数）文本框中显示滑块指示器的当前位置。4.5.3Component（成分）选项卡：显示整个PCR运行期间所选反应孔的每种荧光的完整光谱表现。每次只能显示第一个选取的反应孔。4.5.4AmplificationPlot（扩增图谱）选项卡：在三个AmplificationPlot（扩增图谱）上，您可查看特定样本的扩增后荧光信号读取情况。•AmplificationPlot（扩增图谱）上显示所选反应孔中的所有样本。•Rnvs.Cycle(Linear)（Rn随循环变化，线性）视图：显示校正后报告荧光强度(Rn)荧光随循环变化的曲线。您可通过此图来识别和检查不规则扩增。•∆Rnvs.Cycle(Log)（∆Rn随循环变化，对数）视图：显示荧光(∆Rn)随循环数变化的曲线。您可通过此图来识别和检查不规则扩增•Ctvs.WellPosition（Ct值与反应孔位置关系）视图：显示阈值循环(CT)与反应孔位置的关系变化图。您可通过此图查找探针数据设置中不当设置的极端值。4.5.5StandardCurve（标准曲线）：显示指定为标准的样本标准曲线。SDS软件根据此标准曲线推断并计算出未知样本的量。4.5.6Report（报告）：以表格方式显示所选反应孔的数据。报告中的数据栏取决于正运行的实验分析类型。对于绝对定量实验分析，可能包括以下数据栏：Well（反应孔）、SampleName（样本名）、Detector（探针）、Task（任务）、Ct、StdDevCt（Ct值标准偏差）、Qty（数量）、MeanQty（平均数量）和StdDevQty（标准偏差数量）。Qty（数量）栏中的值根据样本的标准曲线推断并计算得出。在ReportSettings（报告设置）对话框中可设置报告显示格式和打印方式。5.仪器维护保养5.1每星期维护任务•归档或备份SDS反应板文件•使用不脱毛的布块擦拭仪器表面5.2每月维护任务：•执行背景校正•执行计算机硬盘碎片整理程序分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第4页，共4页5.3半年维护任务：•执行纯荧光校正•执行目标区(ROI)校正5.4其它维护任务：需要时执行以下维护任务，以解决遇到的问题：•去除样本块中的污染物•更换卤素灯•更换仪器保险丝6.常见的故障与处理6.1没有标准曲线：•在设置样本信息时，在类型中没有设置为•在设置样本信息中的内没有填入数值6.2没有扩增曲线：•PCR设置参数错误，只收集了一个循环的信号•硬盘休眠，没有收集循环的信号6.3基线下滑：修改基线范围为10-20，重新分析。6.4扩增曲线断裂：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据。6.5直线扩增曲线：探针部分降解7.校准：ABI7500基因扩增检测仪校准工作需由专业工程师进行，每年校正一次，另外以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。通过对室内质控图的分析，及时发现系统误差的出现。经过分析排除了试剂和人员误差后，应进行仪器状态校验实验：7.1使用标准化试剂作为校验试剂，分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。7.3每年由专业人员进行上述实验，仪器若搬动或配套仪器（如UPS等）的变动亦需进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和103标准品是否检出。7.4当104标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。如结果依然，联系厂家进行仪器校准。7.5当仅有104标准品未检出时，检查实验全过程。再次上机检测104标准品两枚。如仍未检出，则联系厂家进行仪器校准。7.6仪器经过校准后，重复该实验，结果归入仪器档案。