荧光定量PCR技术原理

RocheAppliedScience1RealRealRealReal----timetimetimetimePCRPCRPCRPCRPrinciplePrinciplePrinciplePrinciple罗氏诊断产品罗氏诊断产品罗氏诊断产品罗氏诊断产品（（（（上海上海上海上海））））有限公司有限公司有限公司有限公司广州办事处广州办事处广州办事处广州办事处应用科学部应用科学部应用科学部应用科学部杨奇志杨奇志杨奇志杨奇志[e-mail]技术原理技术原理技术原理技术原理
普通PCR技术原理
基于嵌入式染料的荧光定量PCR原理
基于探针的荧光定量PCR原理
荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience3实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术原理技术原理技术原理技术原理
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荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience4PCR原理原理原理原理RocheAppliedScience5信号放大原理信号放大原理信号放大原理信号放大原理RocheAppliedScience6PCR产物的电泳检测和分析产物的电泳检测和分析产物的电泳检测和分析产物的电泳检测和分析RocheAppliedScience7SYBRGreenIHybProbeTaqMan延伸期检测延伸期检测延伸期检测延伸期检测退火期检测退火期检测退火期检测退火期检测延伸期检测延伸期检测延伸期检测延伸期检测Real-timePCR原理原理原理原理RocheAppliedScience8实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术原理技术原理技术原理技术原理
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荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience9SYBRGreenIRocheAppliedScience10Cp(Crossingpoint)orCt(Cyclerthreshold)RocheAppliedScience11实时荧光定量PCR的原理公式
N＝N02n=N0(1+E)n
logN=log(1+E)n+logN0
logN0=-nlog(1+E)+logN
Cp=n=－logN0/log(1+E)+logN/log(1+E)(Y=kX+b)结论：Cp值与模板起始浓度的负对数成线性关系N：扩增产物量;N0：启始模板量;N：循环数;E：扩增效率(0≤≤≤≤E≤≤≤≤1)RocheAppliedScience12绝对定量原理绝对定量原理绝对定量原理绝对定量原理（（（（标准曲线标准曲线标准曲线标准曲线））））标准曲线(外标准或内标准)未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)log(F2/F1)log(F2/F1)CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)TargetRocheAppliedScience13实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术原理技术原理技术原理技术原理
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荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience14FRET现象(Fluorescenceresonanceenergytransfer)RocheAppliedScience15TaqManprobeRocheAppliedScience16TaqManprobeprincipleRocheAppliedScience17杂交探针杂交探针杂交探针杂交探针HybProbe－－－－罗氏专利性技术罗氏专利性技术罗氏专利性技术罗氏专利性技术AnnealingElongationEndofElongationDenaturationFluoresceinLCRedforsequencespecificdetectionofDNARocheAppliedScience18实时荧光PCR检测结果RocheAppliedScience19Denaturationphase:SimpleProbefreeinsolution;emissionofreporterdyeisquenchedAnnealingphase:Fluorescencefromreporterdyeincreaseswhenprobeisannealedtoit‘scomplementarytarget5‘3‘-pQR3‘5‘primer5‘3‘-pQRR=Reporter(Fluorescein)Q=QuencherNewProbeFormat:SimpleProbeFormat-高效低成本的新型探针RocheAppliedScience20实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术原理技术原理技术原理技术原理
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荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience21各种荧光各种荧光各种荧光各种荧光PCR方法的特点方法的特点方法的特点方法的特点
SYBRGreenI染料法：通用性好，灵敏度高，只要在普通PCR反应体系中加入荧光染料，稍优化即可，可通过做溶解曲线来分析扩增产物的成分；特异性差，模板起始浓度不同，本底信号也不同，为提高检测的特异性，需要进行优化工作。适合进行定性检测。
HybProbe探针：特异性好，扩增效率高，并且可通过做溶解曲线来分析突变和基因分型；通用性不好。适合定性、定量以及基因分型（SNP分析）。
TaqMan探针：特异性好，不能做溶解曲线分析；通用性不好，扩增效率因水解作用受影响，信号的产生不依赖于特定的温度，5-3外切酶活力难测定。无法直接进行溶解曲线分析，适合定性、定量分析。
SimpleProbe探针：特异性好，扩增效率高，荧光强度不高，适合做溶解曲线来分析点突变和基因分型。
ResoLightDyes(HRM高分辨率溶解曲线法)：分辨率非常高，可在300bp的扩增产物内区分单碱基突变，主要用于发现未知的SNP突变位点。配合未标记探针，可同时检测已知突变并寻找未知突变。RocheAppliedScience22
可以区分不同的扩增产物（基因突变，基因分型，基因多态性），非特异产物和引物二聚体
熔点（Tm）的定义：50％双链DNA解链成单链时的温度
LC进行熔点曲线分析时，从低温以0.1℃/s升温至95℃，并做连续荧光检测，当50％DNA解链成单链时，荧光强度陡降，从而获得相应的Tm熔点曲线分析鉴定PCR产物RocheAppliedScience23熔点曲线分析（（（（利用利用利用利用SYBRGreenI染料或杂交探针染料或杂交探针染料或杂交探针染料或杂交探针））））RocheAppliedScience24判别引物二聚体————————使用使用使用使用SYBRGreenI染料染料染料染料GelelectrophoresisLightCyclerMeltingCurveAnalysisRocheAppliedScience25错配完全匹配温度低温中温高温熔点曲线分析点突变熔点曲线分析点突变熔点曲线分析点突变熔点曲线分析点突变((((SNP分析分析分析分析))))RocheAppliedScience26突变（SNP）检测－－－－利用杂交探针利用杂交探针利用杂交探针利用杂交探针突变分析突变分析突变分析突变分析MismatchMismatchPerfectMatchPerfectMatchFluorescentSignal-dF/dT°CTemperatureRocheAppliedScience27Real-timePCR的定量的概念的定量的概念的定量的概念的定量的概念RocheAppliedScience28相对定量相对定量相对定量相对定量——管家基因管家基因管家基因管家基因（HousekeepingGenes）定义
编码在细胞功能上活性必需的蛋白质的一系列基因编码在细胞功能上活性必需的蛋白质的一系列基因编码在细胞功能上活性必需的蛋白质的一系列基因编码在细胞功能上活性必需的蛋白质的一系列基因
这些基因通常组成型表达这些基因通常组成型表达这些基因通常组成型表达这些基因通常组成型表达，，，，在所有样本中表达水平接近在所有样本中表达水平接近在所有样本中表达水平接近在所有样本中表达水平接近，，，，可用作管家基因可用作管家基因可用作管家基因可用作管家基因（（（（referencegene））））
通过同一样本中管家基因通过同一样本中管家基因通过同一样本中管家基因通过同一样本中管家基因RNA对目的基因表达水平的校准对目的基因表达水平的校准对目的基因表达水平的校准对目的基因表达水平的校准来衡量目的基因来衡量目的基因来衡量目的基因来衡量目的基因RNA的表达水平的表达水平的表达水平的表达水平管家基因（参照基因）的作用：
检测是否样本材料中检测是否样本材料中检测是否样本材料中检测是否样本材料中RNA降解降解降解降解
纠正样本加样量的差异纠正样本加样量的差异纠正样本加样量的差异纠正样本加样量的差异
校准校准校准校准cDNA合成速率合成速率合成速率合成速率
校正校正校正校正PCR抑制剂的影响抑制剂的影响抑制剂的影响抑制剂的影响RocheAppliedScience29RelativeQuantificationwithExternalStandard:SummaryFluorescenceCyclesReferenceFluorescenceCyclesTargetUnknownSampleResult=ConcentrationofTargetConcentrationofReferenceCyclesFluorescenceStandardsStandardsCyclesFluorescenceCrossingPointLogConcentrationCrossingPointLogConcentrationRocheAppliedScience30Real-TimePCRQuantificationPrinciplesAbsoluteQuantificationRelativeQuantificationExternalStandards(monocolor)ExternalStandards(withoutcalibrator)Calibrator-NormalizedMethodwithoutEfficiencyCorrectionwithEfficiencyCorrectionExternalStandardswithInternalControl(dual-color)QuantificationPrinciplesOverviewRocheAppliedScience31RelativeQuantificationPrincipleAcalibratorcanbeusedfornormalizationofthefinalresults.Itprovidesaconstantcalibrationpointbetweenseveralexperimentsthuscorrectingforrun-to-runandlot-tolotdifferences.Asamplethatisusedfornormaliza