第2节-基本原理与主要分离类型

2021/1/29第三章高效液相色谱分析一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph第二节基本原理与主要类型highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2021/1/29一、基础理论热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程1.塔板理论理理nLH/22212()5.54()16()RRRtttnYY理effeffnLH/''221216()5.54()RReffttnYY0'ttkR2)1(kknneff理2021/1/29（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL（1）2.速率理论（与GC对比）2021/1/292）涡流扩散项及其影响（忽略纵向扩散项后）：uCAHHPLCmDB2TDm相忽略大低，流动相柱温BTRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，（2）讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）dpA2dpA柱效，，nHAdp2021/1/292021/1/293）传质阻抗项及其影响）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，，但易产生气泡mmDTCDT2021/1/2922114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n''''12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0'ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k二、影响分离的因素1.2021/1/291.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右三、HPLC法中分离条件的选择2021/1/291.液固吸附色谱法（LSC）(liquid-solidadsorptionchromatography)2.液液分配色谱法（LLC）(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography3.离子色谱法（IC）（ion-exchangechromatographyandionpairchromatography)4.空间排阻色谱法（SEC）（stericexclusionchromatography四、HPLC法的主要类型2021/1/29一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography1.基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；作用机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异namnmamaamSXSXKnSXnSX]][[]][[分离前提：K不等2021/1/292.固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；影响K的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，K↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，K↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间2021/1/29二、液-液分配色谱及化学键合相色谱liquid-liquidpartitionchromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相中溶解度差异；smmsVVkccK固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；多用化学键合固定相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；2021/1/29正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分。反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2021/1/291.常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面（1）分离机制：分配+吸附不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱2021/1/292.反相键合相固定相（1）分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，K↑，组分tR↑反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，K↓，组分tR↓（2）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）（3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF2021/1/29（4）流动相极性与K的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，K↑，组分tR↑（5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱（6）适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）3.正相键合相色谱（1）分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力（2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相（3）流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2021/1/29（4）流动相极性与K的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，K↓（5）出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱（6）适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等2021/1/29NClCNOCH3CH3HANClCNHOCH3C4H9现分离一含A和B的试样，键合相有十八硅烷基硅胶和氰基硅胶可供选择，流动相有60％甲醇－水和1％二氧杂环己烷－己烷可供选择。（1）若采用正相色谱法，应选用何种固定相和流动相？出峰次序如何？（2）若采用反相色谱法，应选用何种固定相和流动相？出峰次序有否变化？（3）何谓正相色谱和反相色谱？B2021/1/29正相色谱指固定相的极性大于流动相极性的色谱体系，因此应选氰基硅胶作固定相，1％二氧杂环己烷－己烷作流动相。A后于B出峰。反相色谱法指固定相的极性小于流动相极性的色谱体系，因此应选十八烷基硅胶作固定相，60％甲醇－水作流动相。B后于A出峰。2021/1/29三、离子交换色谱ion-exchangechromatography固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2021/1/29四、离子色谱ionchromatography离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。2021/1/29离子色谱仪2021/1/29(IonChromatography,简称IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。1.离子色谱法原理2021/1/29离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2021/1/292.离子色谱的优点（1）分析速度快可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2021/1/29抑制型：抑制柱型、非抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。3.离子色谱装置类型2021/1/29离子色谱连续抑制装置图2021/1/29在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其K和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2）K的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质——加入酸HActR↑，K↑碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，K↑调节pH范围：3.0~8.0pH8.0破坏键合相与载体的结合pH3.0腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物离子抑制色谱2021/1/29对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度K=1~10K=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气2021/1/29阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。4.离子色谱的应用2021/1/29五、离子对色谱ionpairchromatography原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-1