分子植物病理学

分子植物病理学MolecularPlantPathology绪论1、概念（conception）分子植物病理学是在分子水平上研究并解释植物病理现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。2、研究内容(contents)应用分子生物学理论和DNA重组技术，研究植物病害的发生机制，阐明病程中，寄主－病原物相互作用的分子基础；寄主、病原物与病程相关的基因及其结构、表达和调控机制。3、主要研究方法（mainstrategy）◆从“里”到“外”：以研究寄主和病原物的基因为主要对象，阐明寄主－病原物相互作用的有关基因的结构、表达、调控及其产物功能。◆方法导向：先以分子克隆的方法鉴定与致病性有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的影响，确定该基因的类型和作用。◆在分子（DNA）水平上通过互补分析和缺失研究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的调节。4、分子植物病理学的发展（history）分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物病害的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的水平是不平衡的。★植物病毒病害的分子生物学研究1935，W.M.Stanley成功分离出TMV结晶，并证明结晶的大部分组成是protein.1937,E.C.Borden﹠N.w.Pirie报道了TMV的化学组成，提出该病毒由95％protein和5％RNA组成．1955～1956，H.Frankel-Conrat对TMV的蛋白质和核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作用提出了令人信服的证据．可被TMV抗体纯化不能被HR抗体纯化侵染植物RNA供体病毒的特征分离出的病毒颗粒能被HR抗体钝化杂合病毒TMVCPHRRNA1958,Giereretal,用亚硝酸诱变获得TMV突变株,使坏死病斑从0.2%增加到15%,进一步说明病毒RNA的突变与致病功能的关系.★植物细菌病害的分子生物学研究植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗传研究在20世纪70年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了近40年，较DNA双螺旋的发现晚了将近20年。20世纪50～70年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。1953～1956，D.T.Klein﹠R.M.Klein发现根癌土壤杆菌的基因转化与致病性有关的现象。1957，R.R.Corey﹠M.P.Starr发现了菜豆黄单胞的转化作用与其对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。1966，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）1944,发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的培养基上生长。1970，G.Moreletal.发现农杆菌致病菌有两种类型，其区别在于对两种不常见Arg衍生物章鱼碱（octopine）和胭脂碱（nopaline）的代谢不同。1973,J.A.Lippincoot证明，无致病力菌株丧失对上述两种Arg衍生物的利用能力，因此，农杆菌有3种类型。typetoxicoctopinenopalineoctopineopalineA++－+－B+－+－+C－－－－－细菌利用肿瘤组织合成1974～1978，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，1977，M.D.Chilton证明农杆菌的Ti质粒上只有一小段DNA与肿瘤诱发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；1978，J.Schell首次以Ti为载体把带有抗生素抗性基因的转座子Tn7转移到植物细胞中去，开创了以Ti质粒为载体转移外源DNA进入植物的植物基因工程研究日益兴旺，同时对Ti质粒的精细分析和与寄主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点.欧氏杆菌(Erwiniaspp)欧氏杆菌与大肠杆菌相近,同时也是重要植物病原细菌,因此开始分子遗传学研究较早。20世纪70年代,M.P.Starr实验室进行了欧氏杆菌Hfr菌株的结合遗传学研究，，利用营养缺陷型标记转移法对其致病基因进行作图,结果表明,致病基因位于染色体上his和thr两个基因之间.自1984年N.T.Keen首次报道从菊欧氏杆菌(E.Chrysanthemi)中克隆到果胶裂解酶基因后,发表了有关欧氏杆菌中2个种pel基因克隆的报道,其中涉及编码5个主要同工酶的5个pel基因.假单胞细菌(Pseudomonas.spp.)茄青枯假单胞(P.solanacearum)丁香假单胞(P.syringae)大豆斑点病菌(P.s.pv.glycinea)大豆假单胞(P.glycinea)★植物真菌病害的分子生物学研究传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害为模式发展起来的,但在分子病理学方面的进展明显滞后.1979年M.E.Case在粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)和J.Tilburn在巢曲霉(Aspergillus)遗传转化系统试验相继取得成功后,丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速.5、分子植物病理学研究进展（Review）GeneforGeneHypothesis植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗性基因，即寄主分别含有感病基因（r）和抗病基因（R），病原分别含有有毒基因（vir）和无毒基因（avr），只有当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄主表现感病。5.1病原菌致病相关基因的研究进展致病性基因(Pathogenicitygenes)是病原均与寄主植物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因,前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与发展;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。无毒基因(Avirulentgenes)广泛存在于寄主植物的病原中，Staskawiczetal（1984）通过把含无毒基因avrA的大豆丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)6号小种的Cosmid克隆接合转移到不含avrA的小种中，以遗传互补实验，克隆了avrA，这是克隆的第一个无毒基因。随后，许多研究者通过类似的方法从不同的病原(包括细菌、真菌和病毒)中克隆了50多个无毒基因，涉及40～50种病原物。5.1.1植物病毒无毒基因的研究TMV等近10种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。1986,Beachy,etal.将TMVU1株的外壳蛋白cDNA转入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒和植物上。病毒：TMV，ALMV，CMV，TRV，PVX，PVY，SMV，BMV，RSV寄主：烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻5.1.2植物病原细菌无毒基因的研究自第一个植物病原细菌无毒基因avrA从丁香假单胞菌大豆致病变种6号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌等植物病原细菌中克隆了40多个无毒基因，远远超过从其它植物病原菌中克隆到的无毒基因。细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子HR的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是依赖于功能性hrp(Hypersensitiveresponsesandpathogeni-city)基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到寄主细胞质内，从而实现其激发子功能。应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株。杨希才等(2001)从病原细菌PseudomonassyringaePV.tomato中获得的无毒基因avrD(0.93kb)和从病原真菌Phytophthoraparasitica中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别与非专一性病原物诱导启动子Pill和BG组成含2个嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表达载体pYH144和pYHEt。通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯,其中用pYH144载体转化2个品种(克新1号,2号),用pYHEt载体转化3个品种(Desiree,克新2号,4号),通过组织培养分别获得潮霉素(HygromycinB)标记的转基因马铃薯试管苗,对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。5.1.3植物病原真菌无毒基因的研究由于缺乏简便有效的克隆方法,真菌无毒基因的克隆已落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆,这已成为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下游信号转导途径的制约因素之一。番茄叶霉病菌（Cladosporiumfulvum）的无毒基因现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产生的蛋白。其中之一是无毒基因avr9的产物，与番茄抗病基因cf9的产物特异性互作。目前，已对avr9基因产物进行了纯化和测序，明确了其分子结构，为一个63个AA的前体蛋白，C末端含有28个AA的成熟激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。所分离的基因克隆表明，avr9的ORF中有一个59bp的短内含子。能在cf4基因型的番茄上诱导过敏反应的小种专化型激发子及无毒基因avr4的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克隆到无毒基因avr4。稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）的无毒基因稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。《RiceBlastDisease》Zeigler,etal.1994在已鉴定克隆的8个pwi基因（pathogenicityofweepinglovegrass,对画眉草致病）。pwi1基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄主植物品种转化性的概念预测pwi2基因有阻止对画眉草侵染的作用。目前用染色体步查的方法已克隆了pwi2基因，并进行了测序。研究发现，大多数水稻菌株含有1到数个pwi2拷贝。通过研究具有不同寄主专化性的稻瘟病菌株pwi2同源序列的分布，发现pwi是一个多基因家族。亚麻栅锈病菌（Melampsoralini）无毒基因亚麻锈病的寄主－病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出34个抗病基因分别存在于7个群中。用⋎射线进行缺失诱变克隆到4个无毒基因。但目前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。大麦云纹病菌（Rhynchosporiumsecalis）无毒基因大麦近等位基因系Atlas对小种US138.1是感病的，Atlas46带有抗病基因Rrs1是对小种US138.1抗病的。Atlas╳Atlas46第一代、第二代对小种US138.1抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种US138.1产生的3种能诱导细胞坏死的多肽NIP1、NIP2和NIP3在两个品种上诱导坏死的能力是相同的。NIP1、NIP2的存在与不亲和互作中坏死的发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种US138.1的不亲和互作中病程相关蛋白PRHv-1的mRNA的积累水平比在亲和互作中高，而且只有US138.1产生的NIP1能特异地诱导带Rrs1抗病基因的品种产生PRHv-1的mRNA。因此，NIP1可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正在进行。5.2植物抗病基因