肿瘤基因治疗的研究进展-百替生物

@[e-mail]@[e-mail]文献综述肿瘤基因治疗的研究进展李志新邱晓彦马大龙在过去的十年里，随着细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域并已初步取得令人振奋成果，如针对肿瘤细胞、肿瘤的血管改变、肿瘤患者的免疫系统和骨髓变化的基因治疗等。尽管目前还没有哪一种肿瘤基因治疗方法的作用是比较理想的，但都显示出了良好的应用前景。现已证明，肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括：抑癌基因治疗，癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗等。一、针对抑癌基因的基因治疗抑癌基因(Tumorsuppressorgene)，又称抗癌基因(Antioncogene)，根据其功能，该基因又可分为控制细胞增生的看门基因(Gatekeepergene)和维持基因完整的看管基因(Caretakergene)［1］。表1中列出了目前已发现的主要抑癌基因和抑癌候选基因。研究表明，几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。因此，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌基因治疗策略，必将成为肿瘤基因治疗中的一种重要的治疗模式［2］。p53基因是1979年Lane和Grawford在SV40大T抗原基因转染的细胞中@[e-mail]@[e-mail]发现的[3]，是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。迄今已发现的10000种人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变［4-7］。由于这种点突变，直接的后果是导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的p53蛋白，失去抑癌作用。鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高，以正常p53基因治疗肿瘤就自然成了研究的热点。大量的体内外试验已证实，引入p53基因确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其@[e-mail]@[e-mail]出现凋亡[9]。如2002年Kunihisa等［10］利用电穿孔的方法，把野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC-3中，发现肿瘤细胞形态改变，细胞生长速度降低，裸鼠致瘤性消失，进一步研究发现肿瘤抑制是因为其凋亡增加所致。Lesson等［15］从裸鼠尾静脉每隔10-12天注射脂质体与p53的复合物，用于治疗接种于裸鼠皮下的人恶性乳腺癌(含p53突变)，结果大多数p53治疗组的肿瘤消失(8/15)，而对照组只有1只消失(1/22)；停止治疗后，8只已消失的肿瘤1月后无一复发。此外，Ramesh等［16］用脂质体作载体将p53导入肺的原位癌和转移癌中，Hagivara等［8］将载有野生型p53的腺病毒载体直接进行瘤体内注射均可使动物的生存期明显延长。此后，研究者又相继将p53基因导入肝癌、口腔癌、肺癌、头颈部肿瘤以及乳腺癌等肿瘤细胞[11-15]，同样发现类似的结果。但对于不同的细胞类型，p53基因的抑制作用各不相同。除了直接的抑瘤作用外，正常p53基因的导入还可以诱导癌细胞对化疗药物及放疗的敏感性，加快肿瘤细胞的凋亡［17,18］。如Spitz等［15］研究了腺病毒介导的p53基因与放射线对小鼠皮下异体移植SW260结直肠癌的作用，发现小鼠再生的肿瘤受到5Gy的放射治疗后需要15天才能长至1000mm3（一般小鼠仅需2天），如果再施以p53基因治疗，则需要37天，说明p53基因确可提高小鼠对放射线的敏感性。Roth等[19]对于H1299(p53缺陷)肺癌、Nielsen[20]等对于头颈部肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的研究也得出了同样的结论。在众多抑癌基因中，p16基因是另一个研究较多的抑癌基因。因其对细胞周期G1期有特异性调节作用，又称多肿瘤抑制基因1（Multipletumorsupperssor1,MTS-1）,INK4a（Inhibitorofcyclindependentkinase(CDK)4）。正常情况下，P16与细胞周期素D（CyclinD）竞争CDK4、CDK6，抑制它们的活性，使其一系列底物(如Rb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。相反，当p16基因发生异常改变时，细胞增殖失控导致其向癌变发展。p16基因异常的主要表现是以基因缺失为主，在肿瘤中可达80％以上，基因异常的总发生率高于其它已知的抑癌基因，而且p16基因异常分布的瘤谱范围很广。如1994年Okamoto等[21]检测了28种肿瘤中p16的表达（包括食管癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌等），发现多种癌细胞缺失p16基因，表现为纯合性丢失或突变，用构建含有[e-mail]@[e-mail]@100biotech.com表达载体转染p16INK4基因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系SKOV-3，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。1998年Lee等［22］用腺病毒介导p16基因导入肺癌细胞，也可抑制癌细胞的生长和克隆形成，造成细胞周期G1期阻滞。此外还有很多这方面类似结论的研究,如Wu等［23］对乳腺癌细胞（MCF-7）、Lee等［24］对膀胱癌等等。为了探讨p16与p21、p53之间的协同作用，有人［25］将Ad-p16和Ad-p21分别和同时导入肺腺癌细胞系Anip973(高转移潜能)和AGZY83-a中(低转移潜能)，发现虽然p16也能抑制癌细胞的生长，但统计学上无明显作用，然而当与p21共同转染后的癌细胞抑制效果非常显著，克隆形成很少。Ghaneh等［26］将Ad-p53与Ad-p16转染到5种前列腺癌细胞中，发现无论体内、体外，或在体、离体均发现，与单独治疗相比，两者联合可诱发大量的肿瘤细胞凋亡，肿瘤细胞生长严重受到抑制。除了与其他抑癌基因共同转染外，还有很多p16与其它基因疗法合用的研究报道，如Wang等［27］就设计了将p16与GM-CSF共同导入肿瘤细胞，效果也非常理想。因此，p16作为一种新型的抑癌基因，有很多优点，如可特异地阻抑CDK4或CDK6，与恶性肿瘤的联系更加广泛，抑癌机理比较明确，较之间接作用的p53，p16基因对细胞周期有肯定的直接作用。而且p16基因相对分子量较小（只有444bp），仅为p53的1/4,易于基因治疗的操作。所以，其在肿瘤的研究领域以及基因治疗方面的作用倍受瞩目。从表1中可以看出，除了p53,p16外，还有很多抑癌基因如p21,p27,Rb,BRCA等都具有抑制肿瘤细胞生长的作用，但这些基因或多或少均有一定局限性，要么其抑制能力远弱于p53［28］，要么抑瘤谱有限，如BRCA1仅仅是家族性乳腺癌和卵巢癌的遗传易感基因［29］。因此，多种抑癌基因的临床应用尚处于研究阶段。二、针对癌基因的治疗癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。因此，这种基因在人的正常细胞中就已存在。在绝大部分情况下，这类潜在的癌基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用。但是当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。如Ras、Myc、Src等基因，由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性@[e-mail]@[e-mail]调控细胞生长和增殖的信号传导途径，促使细胞异常生长。因此将癌基因反义序列导入癌细胞使之封闭，或引入rev等方法阻止癌细胞的生长是抑制肿瘤的另一种方式。（表2为目前常见的癌基因）如Wei等［30］用反义Myc(片段构建)重组腺病毒载体Ad-As-Myc，发现能显著抑制肺腺癌GLC-82和SPC-A-1细胞生长和克隆形成，并诱导其凋亡。RT-PCR和Western印迹显示MYC基因表达下降，凋亡相关基因Bcl-2和Bax分别出现下调和上调。瘤内注射Ad-As-Myc可抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长(抑瘤率为52％)。对肝癌细胞BEL-7402、HCC-9204、QSG-7701和SMMC-7721、胃癌细胞MGC-803、SGC-823均有抑制作用，表明反义Myc具有广谱的抗肿瘤作用。Jae等［31］以逆转录病毒为载体将反义的K-Ras导入胃癌细胞YCC-1（高表达野生型K-Ras）和YCC-2（K-Ras12位突变）中，发现K-Ras基因的表达显著降低，其癌细胞生长明显受抑，其抑制率近50％。体内实验也证明，未转染反义K-Ras的裸鼠在20天后肿瘤迅速增大，而转染反义K-Ras的肿瘤未见长大。Takeuchi等［32］将含有具有抑制K-Ras功能的突变体N116Y基因腺病毒(AdCEA-N1116Y)导入胰腺癌细胞(PCI-35，PCI-43)，然后再感染裸鼠，发现无论是N116Y的表达，还是肿瘤受抑，抑或凋亡等变化，与对照组(人胚胎胰细胞1C3D3)相比均有显著性差异。Watanabe等［33,34］对膀胱癌的研究也发现了类似的结果。此外，针对癌基因的核酶(Ribozyme,RZ)技术研究也甚多，主要因为RZ能够序列特异性地抑制靶mRNA，区别正常的癌基因和突变型癌基因。如2000年Tokunaga等［35］设计了针对突变型K-Ras癌基因锤头状RZ，观察了其对结肠癌细胞SW480的治疗作用，发现K-RasRZ可特异且有效地切割突变@[e-mail]@[e-mail]的K-RasmRNA，但对野生型的mRNA无作用；体内外均能显著抑制肿瘤的生长。Tsuchida［36］及Kijima［37］等对人类胰腺癌的研究也得出了相同的结论，并证明这种抑制是凋亡所致。而Funato等［38］证明K-Ras