农业部869号公告-2-2007 模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法

ICS67.050X04中华人民共和国国家标准农业部869号公告-2-2007转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法FoodsafetydetectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproductsMethodoftargetproteindigestivestabilityinsimulativegastricandintestinalfluid2007-06-11发布2007-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部869号公告-2-2007前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业大学。本标准主要起草人：黄昆仑、唐茂芝、段武德、罗云波、贺晓云、刘信、宋贵文、沈平、许文涛、厉建盟。I农业部869号公告-2-2007转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法1范围本标准规定了外源蛋白质在模拟胃液和模拟肠液消化稳定性的检测方法。本标准适用于转基因生物及其产品中外源基因表达蛋白质或者用微生物表达的与植物中的外源蛋白具有实质等同性的蛋白质产物在模拟胃液和模拟肠液消化条件下稳定性的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1外源蛋白质exogenousprotein从转基因生物中提取的通过基因工程手段转入生物中的外源基因所表达的蛋白质产物，或者将转基因植物中的外源基因转入微生物中所表达的与植物中的外源蛋白质具有实质等同性的蛋白质产物。2.2模拟胃消化液stimulatedgastricfluid（SGF）模拟人体胃液中的pH值，盐离子浓度及胃蛋白酶浓度设置的消化液。2.3模拟肠消化液stimulatedintestinalfluid（SIF）模拟人体肠液中的pH值，盐离子浓度及胰酶浓度设置的消化液。2.4稳定对照蛋白stablecontrolprotein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中60min内不能被完全消化的蛋白质。2.5不稳定对照蛋白labilecontrolprotein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中2min内完全被消化的蛋白质。3原理根据人体胃/肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃/肠消化体系，将转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在该体系中进行消化，对不同消化时间的样品进行蛋白电泳和蛋白印迹，确定该蛋白在模拟胃液和模拟肠液中被消化的时间，推断转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在模拟人体胃/肠消化过程中的稳定性。4试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯化学试剂和重蒸馏水。4.1模拟胃消化液（SGF）：本标准中采用的胃蛋白酶（pepsin）活力不能低于2000U/mg。1农业部869号公告-2-2007根据公式（1）计算100mL模拟胃液中的胃蛋白酶的添加量：5×10619×BA=……………………（1）式中：A—胃蛋白酶添加量，单位为毫克（mg）；B—胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克（U/mg）。称取0.2g氯化钠（NaCl）和Amg胃蛋白酶，加入70mL重蒸馏水，加入730µL盐酸，再用盐酸调pH至1.2，加水定容至100mL。现用现配。4.20.2mol/L氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠（NaOH），溶于重蒸馏水中，定容至100mL。4.3模拟肠消化液（SIF）：本标准中采用的胰酶（pancreatin）应满足40℃5min内，能将其质量的25倍的淀粉转化为水溶性的碳水化合物；40℃60min内（pH7.5），消化掉其质量的25倍的酪蛋白；37℃（pH9.0），每毫克胰酶每分钟能够从橄榄油中至少水解生成2µmol脂肪酸。称取0.7g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于25mL重蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19mL0.2mol/L氢氧化钠溶液和40mL重蒸馏水，加入1.0g胰酶，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5，加重蒸馏水定容至100mL。现用现配。4.4样品蛋白溶液：4.4.1模拟胃液消化样品蛋白溶液（5g/L）：称取5mg样品蛋白，定容于1mL重蒸馏水中，混匀。4.4.2模拟肠液消化样品蛋白溶液（2g/L）：称取2mg样品蛋白，定容于1mL重蒸馏水中，混匀。4.5不稳定对照蛋白溶液：4.5.1模拟胃液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白（α-casein）或牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）作为模拟胃液消化不稳定对照。配制方法同4.4.14.5.2模拟肠液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白（α-casein）或牛β-乳球蛋白B（bovineβ-lactoglobulin，BLG）作为模拟肠液消化不稳定对照。配制方法同4.4.2。4.6稳定对照蛋白溶液：4.6.1模拟胃液消化稳定对照蛋白溶液：选用牛β-乳球蛋白B（BLG）或大豆胰蛋白酶抑制剂（soybeantrypsininhibitor，STI）作为模拟胃液消化稳定对照。配制方法同4.4.1。4.6.2模拟肠液消化稳定对照样品溶液：选用牛血清白蛋白（BSA）或大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）作为模拟肠液消化稳定对照。配制方法同4.4.2。4.70.2mol/L碳酸氢钠（NaHCO3）溶液：称取1.7g碳酸氢钠（NaHCO3），溶于重蒸馏水中，定容至100mL。4.83mol/L盐酸溶液：量取26mL盐酸，加重蒸馏水定容至100mL。4.9分离胶缓冲液（1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-HCl），pH8.8）：称取9.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3mol/L盐酸溶液调pH至8.8，再加水定容至50mL，4℃下贮存备用。2农业部869号公告-2-20074.10浓缩胶缓冲液（1.0mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-HCl），pH6.8）：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3mol/L盐酸溶液调pH至6.8，再加水定容至50mL，4℃下贮存备用。4.11300g/L丙烯酰胺单体储液（Acr/Bis）：称取29.1g丙烯酰胺（Acr），0.9gN，N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis），溶于80mL重蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至100mL，滤纸过滤，4℃下避光保存备用。4.12100g/L十二烷基磺酸钠（SDS）：称取5.0g十二烷基磺酸钠（SDS）溶于45mL重蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至50mL。4.13100g/L过硫酸铵（AP）：称取0.1g过硫酸铵（AP），溶于1mL重蒸馏水中。4℃中保存，并在1周内使用。4.14蛋白样品上样缓冲液（5×Laemmlibuffer，pH6.8）：称取10.0g十二烷基磺酸钠（SDS），加入40mL甘油，33mL浓缩胶缓冲液（pH6.8），5mLβ－巯基乙醇，加水定容至100mL，再加入0.05g溴酚蓝，混匀。4.1550g/L三氯乙酸（TCA）：称取5.0g三氯乙酸（TCA），溶于100mL重蒸馏水中。现用现配。4.16十二烷基磺酸钠（SDS）洗脱液：在455mL甲醇中加入90mL乙酸，用水定容至1000mL。4.17考马斯亮蓝染色液：量取150mL甲醇，100mL冰乙酸，加水定容至1000mL，再加入1.0g考马斯亮蓝，混匀，滤纸过滤后使用。4.18脱色液：在250mL甲醇中加入75mL乙酸，加水定容至1000mL。4.19电泳缓冲液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷（Tris），14.4g甘氨酸，1.0g十二烷基磺酸钠（SDS），溶于800mL重蒸馏水中，用3mol/L盐酸溶液调pH至8.3，加水定容至1000mL。4.20转移缓冲液：称取3.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），14.4g甘氨酸，甲醇200mL，加水定容至1000mL。4.21TBS缓冲液：称取1.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），8.8g氯化钠（NaCl），加800mL重蒸馏水，用3mol/L盐酸溶液调pH至7.5，加水定容至1000mL。4.22TBST1缓冲液：在500mLTBS缓冲液中，加入250µL吐温20（Tween20），用磁力搅拌器混匀。4.23TBST2缓冲液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷（Tris），4.4g氯化钠（NaCl），加重蒸馏水400mL，再加入500µL吐温20（Tween20），搅拌混匀，加水定容至500mL。4.24碱性磷酸酶显色缓冲液：称取1.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），0.6g氯化钠（NaCl），1.0g氯化镁（MgCl2·6H2O），加80mL重蒸馏水溶解，定容至100mL。4.25蛋白印迹显色液：加66µL四氮唑兰（NBT）溶液于10mL碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀后，加入33µL5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐（BCIP）溶液，混匀。现用现配。4.26封闭液：在50mLTBST1缓冲液中加入1.5g牛血清白蛋白（BSA），混匀。4.27一抗工作液：在50mL封闭液中，加入50µl目标蛋白抗血清。4.28二抗工作液：在20mLTBST2缓冲液中，加入0.2g牛血清白蛋白（BSA），混匀溶解后，再加入20µL碱性磷酸酶标记二抗。4.2915%分离胶：按表1依次吸取各种组分于50mL锥形瓶中，其间摇动混匀。3农业部869号公告-2-2007表115%分离胶的配制各种溶液组分名称各组分的取样量（mL）重蒸馏水2.3300g/L丙烯酰胺储液（Acr/Bis）5.0分离胶缓冲液2.5100g/L十二烷基磺酸钠（SDS）0.1100g/L过硫酸铵（AP）0.1N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）0.004总体积104.305%浓缩胶：按表2依次吸取各种组分于50mL锥形瓶中，其间摇动混匀。表25%浓缩胶的配制各种溶液组分名称各组分的取样量（mL）重蒸馏水3.4300g/L丙烯酰胺储液（Acr/Bis）0.83浓缩胶缓冲液0.63100g/L十二烷基磺酸钠（SDS）0.05100g/L过硫酸铵（AP）0.05N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）0.005总体积54.31PVDF转印膜。4.32滤纸。5仪器5.1恒温水浴(温度波动范围：0.1℃)。5.2紫外分光光度计。5.3电泳槽、电泳仪等蛋白电泳装置。5.4蛋白免疫印迹装置。5.5凝胶成像系统或照相系统。5.6重蒸馏水发生器。5.7可调式电炉。5.8电子天平（感量0.0001g与感量0.1g）。5.9其他分子生物学实验室仪器设备。6操作步骤6.1模拟胃/肠液消化试验反应时间反应时间设置为0s、15s、2min、30min和60min。6.2试验重复和平行样品设置4农业部869号公告-2-2007每个蛋白样品重复进行两次试验，每次试验进行三次电泳。6.3模拟胃液消化试验6.3.1反应时间为0s的模拟胃液消化试验在1.5mL离心管中加入190µL模拟胃消化液（SGF），37℃恒温水浴5min。加入10μL样品蛋白溶液或对照蛋白溶液（5g/L），同时加入70µL0.2mol/L碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，冰浴，加入70µL蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。6.3.2反应时间为15s、2min、30min、60min的模拟胃液消化试验在7mL离心管中加入1.9mL模拟胃消化液（SGF），37℃恒温水浴5min。加入100µL样品蛋白溶液或对照蛋白溶液（5g/L），迅速漩涡振荡并快速置于37℃水浴，准确记录时间，在每个反应时间点，迅速吸取反应液200µL，加入1.5mL离心管中（含有70µL0.2mol/L碳酸氢钠溶液），冰浴，加入70µL蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。6.3.3胃蛋白酶对照在1.5mL离心管中加入190µL模拟胃消化液（SGF），再加入10µL重蒸馏水和70µL0.2mol/L碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，加入70