SN 1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１３５．５—２００７马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊狊狌犫狊狆．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊２００７１２２４发布２００８０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１１３５共分为五个部分：———马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；———马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；———马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；———马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；———马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。本部分是ＳＮ／Ｔ１１３５的第５部分。本部分的附录Ｂ、附录Ｃ均为规范性附录，附录Ａ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１１３５．５—２００７马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法１　范围ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。２　术语和定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分。２．１双抗体夹心酶联免疫吸附测定在固相支持物上（酶联板）包被细菌特异性抗体，加入待测样品后，再用酶标记的细菌抗体进行免疫识别，最后通过酶促化学反应检测细菌是否存在的一种血清学检测方法。２．２犘犆犚以耐热ＤＮＡ聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的ＤＮＡ片段）通过高温（ＤＮＡ分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热ＤＮＡ聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。３　原理马铃薯环腐病菌（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊），属厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）厚壁细菌纲（Ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）棒形杆菌属（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉），依靠病薯进行远距离传播。寄主及世界分布参见附录Ａ。４　仪器和用具４．１　仪器设备ＰＣＲ仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪。４．２　主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。ＰＣＲ缓冲液、氯化镁（ＭｇＣｌ２）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）、硫酸镁（ＭｇＳＯ４）、葡萄糖、琼脂，酶联检测试剂见附录Ｂ。５　病菌的鉴定５．１　症状检查取样品量１％～５％（若样品少可适量增大比例）的块茎进行检查。将块茎横切，检查环腐病菌侵染症状，挤压块茎，检查维管组织是否浸解。发病轻者维管束变黄，呈不连续的点状变色；重者整个维管束环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织，呈环状腐烂，严重时可引起皮层与髓部组织分离，轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显，随病害发展，皮色变暗或变褐，严重时表皮可出现裂缝。５．２　双抗体夹心酶联免疫吸附测定利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录Ｂ），若检测结果为阳性，需进行病原１犛犖／犜１１３５．５—２００７菌的分离培养及５．４方法测定。５．３　病原菌的分离培养５．３．１　培养基的制备营养肉汤酵母膏培养基（ＮＢＹ）：牛肉汁８．０ｇ，酵母膏２．０ｇ，磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）２．０ｇ，磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．５ｇ，葡萄糖２．５ｇ，琼脂１５．０ｇ，水１Ｌ，灭菌后加１ｍＬ过滤灭菌的１ｍｏｌ／Ｌ硫酸镁（ＭｇＳＯ４）溶液。５．３．２　块茎中病原菌的分离培养马铃薯块茎洗净后用７５％乙醇表面消毒５ｍｉｎ，从带病薯块的维管束挑取少量菌脓在ＮＢＹ培养基上划线或从带病块茎的维管束圈切取少量病组织，在灭菌水中捣碎制成悬浮液，用接菌环蘸菌悬液划线，经两次纯化培养后转入培养基斜面。５．４　犘犆犚凝胶电泳检测见附录Ｃ。６　结果判定若酶联免疫检测结果为阳性，可初步判定为检出马铃薯环腐病菌，需利用５．４方法进一步检测。在５．４检测中，若ＰＣＲ凝胶电泳检测结果为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判定为马铃薯环腐病菌。７　样品保存与复核７．１　样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯环腐病菌的样品应保存于４℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。７．２　菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为马铃薯环腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于ＮＢＹ培养基斜面上，２８℃培养４８ｈ，然后４℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入２０％灭菌甘油并混匀，－８０℃长期保存或用安瓿管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。７．３　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。若酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，ＰＣＲ凝胶电泳检测需有电泳结果照片。７．４　复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。２犛犖／犜１１３５．５—２００７附　录　犃（资料性附录）寄主及世界分布犃．１　寄主范围自然寄主只有马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿），接种寄主有番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）、茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狉犪）等。犃．２　分布地区阿富汗、日本、柬埔寨、朝鲜、黎巴嫩、尼泊尔、土耳其、中国、中国台湾、巴基斯坦、越南、俄罗斯、捷克、斯洛伐克、丹麦、芬兰、挪威、波兰、瑞典、加拿大、美国、哥斯达黎加、巴拿马、秘鲁、委内瑞拉、德国、希腊、前南斯拉夫、葡萄牙、奥地利、哥伦比亚、法国、墨西哥、罗马尼亚、比利时。附　录　犅（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定犅．１　试材犅．１．１　酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犅．１．２　包被抗体特异性的马铃薯环腐病菌抗体。犅．１．３　酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的马铃薯环腐病菌抗体。犅．１．４　底物溶液对硝基苯磷酸二钠（ρＮＰＰ）１００ｍｇ溶解于底物缓冲液１００ｍＬ中，现配现用。犅．１．５　样品抽提缓冲液溶于１Ｌ　１×ＰＢＳＴ：亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）　　　　　　　　　１．３ｇＰＶＰ（ＭＷ２４０００～４００００）２０．０ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ吐温２０　（ｔｗｅｅｎ２０）２０ｍＬ调ｐＨ值至７．４，４℃冰箱保存。犅．１．６　包被缓冲液碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ溶于蒸馏水，调ｐＨ值至９．６，蒸馏水定容至１０００ｍＬ，４℃冰箱保存。犅．１．７　犘犅犛犜缓冲液（洗涤缓冲液）溶于１Ｌ蒸馏水３犛犖／犜１１３５．５—２００７氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ调ｐＨ值至７．４，４℃冰箱保存。犅．１．８　酶标抗体稀释缓冲液溶于１Ｌ　１×ＰＢＳＴ：ＢＳＡ（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉２．０ｇＰＶＰ（ＭＷ２４０００～４００００）２０．０ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ调ｐＨ值至７．４，４℃冰箱保存。犅．１．９　底物（ρ犖犘犘）缓冲液溶于８００ｍＬ蒸馏水：氯化镁（ＭｇＣｌ２）０．１ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ二乙醇胺９７ｍＬ用ｐＨ值调至９．８，蒸馏水定容至１Ｌ，４℃冰箱保存。犅．２　程序犅．２．１　包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板孔中，１００μＬ／孔，加盖，３７℃孵育２ｈ，清空孔中溶液，ＰＢＳＴ洗涤４次，每次３ｍｉｎ。犅．２．２　样品制备待测样品按１∶１０（重量∶体积，犠／犞）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，２００犵离心１０ｍｉｎ，上清液即为制备好的检测样品。对于块茎可以在加有适量抽提缓冲液的厚塑料袋中拍碎，取上清液。对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。犅．２．３　加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，１００μＬ／孔，加盖，３７℃孵育２ｈ或４℃冰箱孵育过夜，ＰＢＳＴ洗涤４次，每次３ｍｉｎ。每个样品重复２次。犅．２．４　加酶标抗体根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，１００μＬ／孔，加盖，３７℃孵育２ｈ，ＰＢＳＴ洗涤４次，每次３ｍｉｎ。犅．２．５　加底物将底物ρＮＰＰ加入到底物缓冲液中，终浓度为１ｍｇ／ｍＬ（现配现用），按每孔加入１００μＬ，室温避光孵育３０ｍｉｎ。犅．２．６　读数３０ｍｉｎ后用酶标仪在４０５ｎｍ处读犗犇值。犅．３　结果判断犅．３．１　对照孔的犗犇４０５值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的犗犇４０５值均小于０．１５，当阴性对照孔的犗犇４０５值小于０．０５时，按０．０５计４犛犖／犜１１３５．５—２００７算；阳性对照犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值大于５～１０；重复性好。犅．３．２　在满足了Ｂ．３．１质量要求后，结果作如下判断：样品犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值明显大于２，判为阳性；样品犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值明显小于２，判为阴性。若采用商品化试剂盒，按照试剂盒说明操作并判定结果。附　录　犆（规范性附录）犘犆犚凝胶电泳检测犆．１　病原细菌犇犖犃的提取犆．１．１　将供试菌株在斜面培养基上２８℃培养４８ｈ。犆．１．２　每一试管中加入０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液５ｍＬ洗下菌苔。犆．１．３　将细菌悬浮液转移至一干净的１０ｍＬ离心管中，１００００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，加入ＴＥ缓冲液５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液３００μＬ，２０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ３０μＬ，混匀，３７℃水浴孵育１ｈ。犆．１．４　加入等体积的三氯甲烷／异戊醇（２４∶１）混匀，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液。犆．１．５　加入等体积三氯甲烷／异戊醇（２４∶１）混匀，１２０００犵离心１０ｍｉｎ。犆．１．６　将上清液移至一新管，加入０．６倍体积的异丙醇，混匀，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液；７０％乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，将ＤＮＡ溶解在１００μＬ灭菌双蒸水中。注：病原菌ＤＮＡ提取也可省略，可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行ＰＣＲ反应。犆．２　引物序列正向引物：５′ＡＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＣ３′，反向引物：５′ＴＣＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣ３′犆．３　犘犆犚反应体系及参数犆．３．１　犘犆犚反应体系见表Ｃ．１。表犆．１　犘犆犚反应体系试　剂　名　称终　浓　度１０×ＰＣＲ反应缓冲液１×氯化镁（ＭｇＣｌ２）２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ正向引物０．２μｍｏｌ／Ｌ反向引物０．２μｍｏｌ／Ｌ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶２．５ＵＤＮＡ模板１μＬ补Ｈ２Ｏ至５０μＬ５犛犖／犜１１３５．５—２００７犆．３．２　阴性对照、阳性对照和空白对照的设置———阴性对照：以待测健康的马铃薯叶片ＤＮＡ为模板；———阳性对照：采用马铃薯环腐病菌或含有待测基因序列的质粒；———空白对照：设两个，一是提取ＤＮＡ时设置的提取空白对照（以Ｈ２Ｏ代替样品），二是ＰＣＲ反应的空白对照（以水代替ＤＮＡ模板）。犆．３．３　犘犆犚的反应参数：９５℃／３ｍｉｎ；９５℃／３０ｓ，６０℃／３０ｓ，７２℃／４０ｓ，３５个循环。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犆．３．４　琼脂糖凝胶电泳制备２％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和ＰＣＲ扩增产物，用ＤＮＡＭａｒｋｅｒ作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性ＤＮＡ条带，并拍摄记录。犆．４　结果判断通过观察，若有２０５ｂｐ大小的产物带出现，可判定为阳性。６犛犖／