电子显微镜样品制备与观察-电子显微镜样品制备

电子显微镜样品制备与观察河北大学生命科学学院主要内容样品的取材与固定样品的渗透与包埋修快与支持膜的制备玻璃刀的制作与超薄切片电子染色电子显微镜的使用与生物样品超微结构观察一、样品的取材与固定（一）实验目的1掌握电镜样品取材的方法与要求2掌握电镜样品的固定方法与要求（二）实验原理（见原理部分）（三）实验材料小白鼠肝脏（等）（四）实验方法1动物麻醉将小白鼠放入烧杯，放入一蘸有氯仿的脱脂棉球，用培养皿盖住烧杯口，约3～5min后小白鼠被麻醉；2解剖分割迅速解剖，取出肝脏，在硬纸上用新单面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3小块，迅速投入准备号的固定液；3前固定2.5%戊二醛0~4℃固定1~2h（固定液需提前准备号）；4漂洗0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃；5后固定1％鋨酸固定1～2h，0～4℃；6漂洗0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃；7脱水30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇，0～4℃，每步5～10min；8保存70％乙醇0～4℃保存。（五）实验要求1用具干燥；2取材快、准、小、轻；3鋨酸有毒，需在通风厨中进行，含鋨酸的废液放入指定容器；4每人固定2～3块样品；5在固定的过程中要不断震动样品管。二、样品的渗透与包埋（一）实验目的掌握超薄切片样品渗透与包埋的方法（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次保存的材料（四）实验方法1脱水85％乙醇→95％乙醇→100％乙醇→100％乙醇，每步5~10min；2置换丙酮→丙酮，每步5~10min；3渗透1/2丙酮+1/2环氧树脂1~4h；4包埋先将包埋模块加满环氧树脂，再将渗透过的材料用牙签挑到包埋模块尖端部分，并在其中渗透3~4h；5聚合加热37℃→45℃→60℃，各12h。（五）实验要求1所用器具、工具保持清洁干燥；2手上若沾有环氧树脂，用丙酮棉球擦去；每人包埋2～3个样品块。三、修快与支持膜的制备（一）实验目的1掌握超薄切片包埋块修快的方法；2掌握支持膜制备的方法。（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次实验包埋的材料（四）实验方法1修快（1）用样品夹头夹住环氧树脂包埋块的2/3左右，夹紧，或用手拿住样品块；（2）用小钢锉或单面刀片修快使达到下面要求：切面光滑平整，尽可能是要观察的材料，切面大小0.5*0.5mm2；3～4个斜面的坡度以45度为宜。2支持膜的制备（1）将玻璃条、250ml烧杯洗净，玻璃条先用纱布擦干，然后再用绸布用力反复擦净，250ml烧杯装满蒸馏水；（2）将玻璃条放入0.2~0.3%聚乙烯醇缩甲醛的氯仿溶液中2~4cm深，停留3~5s后提出，在空气中自然干燥；（3）在玻璃条四周用单面刀片将膜轻轻划开，然后以与水面30度角缓慢插入放在日光灯正下方的250ml烧杯的蒸馏水中，同时用眼观察(使眼正好能看到水面反射的日光灯的光线)，使膜完全脱离玻璃条而漂浮在水面上，膜应为均匀的灰色（约15nm）；（4）将2～4片载网放在膜上，再用镊子轻压1～2下，使载网与膜紧贴；（5）再用比膜稍大的滤纸放在膜的上方，轻压下滤纸一角，在滤纸刚好全部湿润之际将滤纸提起，载网与膜亦贴在滤纸上；（6）将膜向上保存于培养皿中备用。（五）实验要求1制膜所用的器具、蒸馏水、纱布、绸布必须干净，用后洗净，制膜过程要防尘；2每人修快2块，制膜2张，将修好的样品块用纸包好写上组号姓名；3预习下次实验。四、玻璃刀的制作与超薄切片（一）玻璃刀的制作（二）超薄切片五、电子染色1蜡盘的制作在培养皿中注入融化的石蜡，让其逐渐凝固；2滴加染液3铀染4水洗5铅染6水洗7干燥六、电子显微镜的使用与样品超微结构观察（一）JEM-100SX透射电子显微镜的使用1启动：闭合电子显微镜稳压电源开关与冷却循环水稳压电源开光，压下启动按钮。约30分钟后仪器进入可工作状态。2放入样品：按程序放入样品。3加高压：有下列几档可选40KV、60KV、80KV、100KV，若需高压应先加低压。选择加速电压原则：电压越高，分辨率越高，反差越小；反之，电压越低分辨率越低，反差越大。4加灯丝电源：顺时针旋转至限位处（加灯丝电源必须有高压存在），此时应看到图象，若不能看到图象，请与专职人员联系，切勿随意调整各旋钮。5观察:调整放大倍数、亮度、样品XY平移、焦距进行观察。6照相：将要照相部位移至视野中心标记方框内，过卷，调整焦距、亮度至自动曝光两个绿灯同时亮，抬起荧光屏进行曝光。7关机：将放大倍数调至1000X，调整亮度正好充满荧光屏，取出样品，灯丝旋钮调至最低，高压调至OFF，压下关闭按钮，约5分钟后仪器关闭，切断两个稳压电源开关。8记录：包括使用起至时间、观察内容、使用人及所属单位及导师，仪器工作情况。（二）样品超微结构的观察