DB51 T 613-2006 柑桔黄龙病检验鉴定技术规程

ICS备案号：DB51四川省地方标准DB51/T613—2006柑桔黄龙病检验鉴定技术规程RuleofDetectionMethodforCitrusHuanglongbingDisease2006-08-04发布2006-08-15实施四川省质量技术监督局发布203DB51/T613—2006I目次1范围..............................................................................2052规范性引用文件....................................................................2053术语和定义........................................................................2054原理..............................................................................2055田间调查..........................................................................2056样品采集..........................................................................2057柑桔黄龙病菌分子鉴定(PCR).........................................................2068结果判定..........................................................................2089检测后样品的处理..................................................................208附录A（资料性附录）柑桔黄龙病症状特征............................................209附录B（资料性附录）柑桔木虱形态特征..............................................210DB51/T613—2006204前言本标准的附录A和附录B是资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省农业厅植物检疫站负责起草，重庆大学参加起草。本标准主要起草人：赵兰鸰、宁红、王中康、陈素清、李刚、帅波、夏雨先、袁青。DB51/T613—2006205柑桔黄龙病检验鉴定技术规程1范围本标准规定了柑桔黄龙病的田间症状调查、实验室分子检验技术要求。本标准适用于对芸香科植物感染柑桔黄龙病植株以及柑桔黄龙病菌传播媒介的检验、检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5040-2003《柑桔苗木产地检疫规程》DB51/T447-2004《柑桔溃疡病检验鉴定标准》3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1柑桔黄龙病CitrusHuanglongbing由CandidatusLiberibacterasiaticus引起、主要由柑桔木虱Diaphorinacitri传播的一种危害柑桔属、金柑属和枳属植物叶片、枝条和果实的检疫性病害。4原理柑桔黄龙病的田间症状复杂多样，该病菌属难培养菌，目前尚无法进行人工培养，因此，在鉴定时除了进行田间识别外，主要采取病原菌DNA体外扩增的方式进行检测。用根据柑桔黄龙病菌核糖体基因序列设计的一对特异性引物与模板DNA(即待检样品中病原菌DNA)进行聚合酶链式反应(PCR)，引物与模板DNA结合后，在DNA多聚酶的作用下，使样品所带的微量柑桔黄龙病菌DNA分子多次成倍扩增，最终通过凝胶电泳分离检测出382bp的柑桔黄龙病特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有柑桔黄龙病菌。5田间调查5.1症状调查用目测方法检查叶片、果实、枝条，症状特征参见附录A。发现疑似症状样本送实验室检验。5.2柑桔木虱调查4月～9月检查柑桔植株的新芽、嫩梢上有无柑桔木虱，柑桔木虱形态特征参见附录B。发现柑桔木虱将其送实验室检测是否带柑桔黄龙病菌。6样品采集6.1柑桔叶片采集6.1.1鉴定取样DB51/T613—2006206采有典型和疑似症状的嫩梢叶片，样品装入牛皮纸袋中，5天内送实验室检验，取样数量按照DB51/T447-2004执行。6.1.2监测取样采取五点取样法，采摘嫩梢叶片，每株分东南西北四个方位采集，样品装入牛皮纸袋中，5天内送实验室检验，取样数量按照DB51/T447-2004执行。6.2柑桔木虱采集用捕虫网在柑桔园内柑桔植株嫩梢上捕捉柑桔木虱，将木虱放入95％酒精中密闭保存，送实验室检验。7柑桔黄龙病菌分子鉴定(PCR)7.1试剂除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。7.1.1灭菌超纯水ddH2O7.1.2PCR缓冲液[×10]7.1.3特异性引物对[50µM]7.1.4dNTP[25mM]7.1.5MgCl2[25mM]7.1.6Taq酶[5µ/µL]7.1.7DNAladder100-600bp7.1.8100％异丙醇溶液7.1.9Tris液[1M]称取12.14gTris试剂，加水搅拌溶解，配好后高压灭菌。7.1.10EDTA液[1M]称取37.224gEDTA试剂，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，边搅拌边加入NaOH，调pH值至8.0，加热溶解,直到溶液澄清，高压灭菌。7.1.11SDS液[10%]称取20gSDS粉末，加热到68℃助溶。7.1.12提取液取Tris液10mL，EDTA液40mL,SDS液10mL，加热搅拌至70℃混合均匀，调pH=8.0，高压灭菌，室温保存。7.1.13蛋白酶K液[10µg/µL]称取5mg蛋白酶K,加入500µL无菌超纯水水混合均匀，-20℃保存。7.1.14异硫氰酸胍液[4M]称取23.63g异硫氰酸胍溶于20mL水，62℃加热助溶，4℃保存。7.1.15电泳缓冲液TAE在1L水中加入Tris碱242g，冰醋酸57.1mL和37.2gNa2EDTA·2H2O，pH8.5，配置成50倍贮存液；使用时稀释为1倍工作液。7.1.16琼脂糖凝胶[2%]在TAE溶液中加入2%琼脂糖，融化后在每100mL琼脂糖中加入5µLDNA荧光染料(GV)，冷却至60℃倒入相应制胶槽中，插入梳子，冷却凝固。7.2仪器和用品用具PCR检测需要以下主要仪器设备和用品：——PCR扩增仪——水平电泳仪——高速台式离心机，离心力可达10000g以上。——凝胶成像系统——微量移液器一套：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，200μL～1000μL——DNA微滤柱——PCR反应管7.3试样制备7.3.1样品存放DB51/T613—2006207采集的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过一周，若需长期保存，应置于-70℃以下，冻融不超过3次。7.3.2样品预处理7.3.2.1叶片随机的选取柑桔叶片，流水清洗干净，吸水纸擦干，取叶柄和叶片中脉0.2g，置于培养皿内用无菌剪刀将材料剪碎，装入1.5mL离心管中。7.3.2.2柑桔木虱将采集的柑桔木虱1头～5头，装入1.5mL离心管中，用研磨棒将其磨碎。7.3.3样品DNA提取DNA提取按照以下步骤进行：——在装有样品的离心管中加入800µL提取液和10µL的蛋白酶K液，混合均匀后置于65℃水浴1h。——吸取上清液转入新的1.5mL离心管，加入上清液1/2体积的异硫氰酸胍液，混合均匀，室温下放置10min，10000g离心10min。——吸取上清液加入微滤柱中，10000g离心1min，弃滤液。——向微滤柱中加入100％异丙醇500µL，10000g离心1min，弃滤液。——重复上一步骤，至滤液无植物色素。——空微滤柱10000g离心1min。——向微滤柱中加入50µL灭菌超纯水，10000g离心1min，收集滤液，即为样品模板DNA。7.4PCR检测7.4.1检测体系柑桔黄龙病PCR检测体系见表1，体系总体积25µL/管。表1柑桔黄龙病PCR检测体系检测试剂终浓度每管加入量µLPCR缓冲液1×2.5引物对0.25µM0.125dNTP0.3mM0.3MgCl22mM2Taq酶1U/25µL1ddH2O－17.075模板DNA20－50ng/25μL2总体积257.4.2PCR反应依次将PCR缓冲液、引物对、dNTP、MgCl2、Taq酶、ddH2O和模板DNA按照表1体系浓度要求加入PCR反应管，放入PCR仪，PCR反应程序为：94℃2min；进入循环，92℃20s，56℃30s，72℃45s，30个循环；72℃7min，4℃下保存。检测时同时设阴性对照和阳性对照。7.5电泳及成像7.5.1电泳将PCR产物8µL与样品缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设DNAladder作为片段大小的标准。100伏电压电泳约半小时。DB51/T613—20062087.5.2成像及分析将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。8结果判定田间症状作为一种辅助诊断手段。样品PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，凝胶上阳性对照出现一条382bp特异性条带，阴性对照没有该特异性条带；供试样品出现与阳性对照相同大小的382bp特异性条带，样品为阳性，即带柑桔黄龙病菌；供试样品未出现与阳性对照相同大小的382bp特异性条带，样品为阴性，即不带柑桔黄龙病菌。9检测后样品的处理用于柑桔黄龙病检测的样品、用具在完成检验后，用具应进行灭活处理，样品集中销毁。DB51/T613—2006209附录A（资料性附录）柑桔黄龙病症状特征A症状特征柑桔黄龙病不同时期不同部位的典型症状如下：A.1春梢病树上当年抽生的春梢叶片转绿后，自5月开始其新梢成熟叶片一般沿主侧脉附近、叶片基部及边缘褪绿黄化，形成黄绿相间的斑驳症状。特点：春梢叶片转绿后才褪绿变黄；叶片黄化程度较轻且不均匀，形成斑驳；发病的新梢较多，在树冠的上、中、下部均有出现；春梢病状发展较快，在4-5年生树龄的春梢上出现病状后，一般到冬季便可全株发病。A.2夏秋梢5-8月抽生的夏梢症状表现与8-10月抽生的秋梢基本相同，病梢一般出现在树冠顶部，多数1-2梢或少数几梢出现。感病的夏秋梢在叶片老熟过程中往往叶脉先变黄，随后叶肉由淡黄绿变成黄色，均匀黄化，形成黄梢。A.3病梢中后期症状当年感病的黄梢一般在秋末先后落叶成秃枝，翌年春季秃枝重新萌发新芽，且时间早萌芽多，所形成的新梢短而纤弱，叶片窄小，叶片老熟时，叶肉停止转绿变黄，但叶脉和其附近组织仍绿色，症状与缺锌、缺锰相似，形成花叶。A.4果实症状感病中期病树所结果实，一般外形变小、畸形，坚硬，着色不均匀，果顶青色；果肉汁少、味酸、渣多，风味极差；种子变褐，发育不健全。DB51/T613—2006210附录B（资料性附录）柑桔木虱形态特征B.1分类地位柑桔木虱Diaphorinacitri属同翅目Homoptera木虱科Psyllidae。B.2形态特征B.2.1卵成虫卵近椭圆形，上端尖细，下端钝圆，形似杧果。有一短柄、桔黄色，长0.3毫米，散生或不规则聚生。B.2.2成虫体长2.8～3.2毫米，全身青灰色，有刻点，上有白蜡粉，头部灰褐色，头部前方的两个颊锥凸出明显。触角10节，灰黄色，端部2节黑色，末端具2根长短不一的硬毛。前胸略隆起。前翅半透明，散布褐色斑纹，前缘色深形成褐色带，近外缘的边上有5个半圆形透明斑。脉序“介”字形分枝，缺翅痣。后翅稍短无色透明。足黄色