DB13T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定

ICS67.100X16DB13?可北省地方标准DB13fT1080-2009乳及乳制品中~-内酷股酶的测定DetectionofJ3-lactamasesinmilkandmilkproducts2009-05-27发布2009-06-11实施河北省质量技术监督局发布食品伙伴网目U昌本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。本标准第一法主要起草人:周正、周巍、李丛芬、穆燕魁、张岩。本标准第二法主要起草人:李挥、张敬轩、庞坤、范斌、张岩。本标准第三法主要起草人:闰静辉、陈英珠、吴萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚瑛。食品伙伴网一2009乳及乳制品中卡内酷股酶的测定第一法杯碟法1范围本标准规定了乳及乳制品中。一内酷胶酶的检验方法-杯碟法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性且对舒巴坦敏感的自-内酷胶酶的检验。本方法的检出限为4U1rnL。2原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制自-内酷胶酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对加入自-内酷胶酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小米间接测定样品中的日-内航胶酶。3设备和材料3.1抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱:36C±1c。3.3高压灭菌器。3.4元菌培养皿:内径90mm，具陶瓦盖。3.5元菌牛津杯:外径(8.0±0.1)mm,内径(6.0士0.1)mm，高度(10.0±0.l)mm。3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。3.7无菌吸管:1mL(0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)。3.8加样器:5μL~20μL，20μL~200μL及配套吸头。4培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，71为CBII'6682中规定的三级水。4.1试验菌种:藤黄微球菌(Micrococcusluteus,CMCC(B)28001)，使用菌株代数3-14代。4.2磷酸盐缓冲榕液:按附录A中A.1规定。4.3生理盐水(8.5giL):按附录A中A.2规定。4.4青霉素标准洛液:按附录A中A.3规定。4.5~-内毗胶酶标准榕液:按附录A中A.4规定。4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.S规定。4.7营养琼脂培养基:按附录A中A.6规定。4.8抗生素检测用培养基IT:按附录A中A.7规定。4.9空白牛奶:按附录A中A.8规定5操作步骤5.1菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1c培养18h~22h，用无菌生理盐水洗下菌苔即为食品伙伴网菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1X1010CFU/mL,4C保存，贮存期限2周。5.2样品的制备将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为:A、B、C、D，每个样品做三个平行。5.3对照的制备5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中共四管，分别标为:A、B、C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加入。-内酷胶酶标准榕液25μL，共做四管，分别标为A，B,C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用平板的制备取90mm灭菌培养皿底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基E凝固后上层加入5mL含有浓度为1XI08CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基E每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯。5.5样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准榕被、自-内酷胶酶标准榕液、舒巴坦标准揭穿液加入到5.2各离心管中:A青霉素5μL。B舒巴坦25μL、青霉素5μL。C~-内酷胶酶25μL(终浓度4U!mL)、青霉素5μL。D~-内酷胶酶25μL(终浓度4U/mL)、舒巴坦25μL、青霉素5μL。将上述A'D试样混匀后各取200μL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36土IC培养18'22h，测量抑菌圈直径。取主组平行试验平均值。6结果观察各平行试验结果差异应小于2.0mm;阴性对照与阳性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。表1实验现象对应表阴性对照阳性对照A抑菌圈直径应在20土2.0rom范围内B、D均产生抑菌圈B、D均产生抑菌圃C抑菌圈与D抑菌圃差异大于等于3.0romC抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0romA抑菌圈与B抑菌圈差异小于3.0mmA抑菌圈与B抑菌阁差异大于等于3.0rom7结果报告7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象一致可判定检验结果阴性。2食品伙伴网第二法高效液相色谱一质谱/质谱法1范围本标准规定了乳及乳制品中具有活性的自-内酷胶酶的高效液相色谱-串联质谱的定性检测方法。本标准适用于生鲜乳、巳氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性的。-内酷胶酶的定性检验。本方法对自-内酷胶酶的检测低限为4UlmL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBff6682分析实验室用水规格和实验方法(GB厅6682-2008，ISO3696:1987,MOD)。3原理利用自-内酷胶酶酶解青霉素族药物的原理，在试样中加入一定量氨节青霉素，酶解后，试样中氨节青霉素经乙腊-水榕液提取，提取液浓缩后，用缓冲榕液溶解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨节青霉素酶解率，间接定性。-内酷胶酶。4试剂除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GBff6682规定的一级水。4.1乙睛:高效液相色谱级。4.2甲醇:高效液相色谱级。4.3甲酸:高效液相色谱级。4.4氯化销。4.5氢氧化锅。4.6磷酸二氢饵。4.7磷酸氢二饵。4.80.1moLnl氢氧化铀:称取4g氢氧化锅，并用水稀释至1000mL。4.9乙睛+水(15+2，体积比)。4.10乙睛+水(30+70，体积比)。4.110.05moLnl磷酸盐缓冲榕液(pH=7.0):称取3.4g磷酸二氢饵，超纯水溶解，稀释至1000mL,用氢氧化铀调节pH至7.0±O.l。4.120.01moUL乙酸镀榕液(pH=4.5):称取0.77g乙酸钱，超纯水榕解，稀释至1000mL，用甲酸调节pH=4.5土0.1。4.13氨节青霉素标准品:纯度大于等于959忘。4.14标准储备榕液(100μg/mL):称取适量标准品(4.14)，用超纯水溶解并定容至10∞mL，置于-18t:冰箱避光保存，保存期5d。4.15标准工作榕液:吸取适量的氨书青霉素标准储备液(4.15)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱，或相当者:500mg,6mL，使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1mL7.l淋洗小柱。3食品伙伴网仪器5.1液相色谱-质谱/质谱仪(LC-MS/MS):配有电喷雾离子掘。5.2旋转蒸发器。5.3固相萃取装置。5.4低温冷冻离心机。5.5均质器。5.6涡旋?昆合器。5.7pHi'十。5.8氮吹仪。6试样制备与保存取代表性样品，混匀后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0~4C冷藏存放。7分析步骤7.1氢韦青霉素的加入称取109样品(精确到0.01g)于50mL离心管中，加入0.1mL氨节青霉素标准储备液(4.15)，混匀。7.2酶解将7.1试样置于37C'恒温水浴，酶解1h。7.3提取在7.2酶解后的试样中加入20mL乙睛(4.9)，均质提取30S,4000rlmin低温冷冻离心5min，上清液转移至50mL离心管中;另取一离心管，加入10mL乙腊水溶液(4.9)，洗涤均质器刀头，用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头榕液，在涡旋I昆合器上振荡1min,4000../min低温冷冻5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛7](榕液(4.9)洗涤刀头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙脂水溶液(4.9)定容至50mL。准确移取25mL于100ml鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上(37C水浴)蒸发除去乙睛，易起沫样品可加入4mL饱和氯化铀榕液。7.4净化迅速向已除去乙腊的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲榕液(4.11)，涡旋混匀1min，用0.1mol几氢氧化铀调节pH为8.5，通过经过预处理的固相萃取柱，流速控制在1mUmin，先用2mL磷酸盐缓冲榕液(4.11)淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗，然后用3mL乙睛洗脱，流速控制在1mUmin。将洗脱液于45C下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液(4.12)定容至1mL，过0.22μm滤膜，供LC-MS/MS分析。7.5测定7.5.1参考色谱条件7.5.1.1色谱柱:ODS-C18柱，250mmx4.6mm，粒度5μm，或相当者。7.5.1.2流动相:A组为0.01mallL乙酸锻榕液(甲酸调pH至4.5);B组为乙睛。A:B=90:1O。7.5.1.3流速:1.0mUmin。7.5.1.4进样量:10μL。7.5.2参考质i普条件7.5.2.1离子源:电喷雾离子掘。7.5.2.2扫描方式:正离子扫描。7.5.2.3检测方式:多反应监测(MRM)。7.5.2.4毛细管电压:4000Vo4食品伙伴网一20097.5.2.5雾化气压力:0.055MPa。7.5.2.6干燥气流速:10Umino7.5.2.7离子源温度:350'1:。7.5.2.8定性离子对、定量离子对等参数见表1。表1氨节青毒素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和碰撞电压定性定量碰撞气碰撞名称离子对离子对能量电压(m/z)(m/z)(V)(V)氨书青在1素350/192350/16010120ampicillin350/1607.5.3液相色谱-质i普/质i普测定7.5.3.1定性测定选择氨节青霉素的1个母离子，2个及以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5%之内;样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准洛液的色谱图中离子相对丰度比，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差%相对离子丰度5020-5010-20主主10允许的最大偏差士20士25士30士507.5.3.2定量测定用氨节青霉素标准储备溶液配成的基质标准溶液(4.16)进样分析，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行单点校准，外标法计算。7.5.4本底实验除不加氨节青霉素外，均按上述操作步骤进行。8结果计算与表述8.1试样中氨节青霉素含量的计算试样中氨书青霉素的含量(μ趴cg或问ι):按式(1)计算AxCsxVx=……………………........……...........(l)AsxW式中:X一一试样中氨节青霉素的