化学生物学-第七章-化学物质与酶的相互作用

第七章化学物质与酶的相互作用自然界中发现的酶已达3000多种，而且这个数目随着基因工程和蛋白质工程方面研究的发展而大大增加。酶可以直接作为药物用于医药工业，如溶菌酶可治疗各类炎症，如咽喉炎、口腔溃疡、慢性鼻炎、带状疤疹及各种刀伤引起的发炎等，天冬酞胺酶治疗癌症，治疗血栓的尿激酶等。酶也广泛应用于食品工业、化学工业、医药工业、环保工业等，在临床检验、生物分析等领域也广泛使用。另外，每种酶都有一定的抑制剂，这类抑制剂可以参与生物代谢过程的化学调控，因此有些酶抑制剂可能属于毒物，而有些抑制剂可以作为药物使用。酶抑制剂作为新药寻找与开发，在近一、二十年来分子生物学发展的基础上得以实用化。化学物质（无机物质、有机物质和高分子物质）与酶的相互作用包括化学物质对酶的激活作用、抑制作用、改性作用和酶对化学物质的催化作用等。第一节化学物质对酶的抑制作用凡能降低酶促反应速度的作用，称为酶的抑制作用。能使酶活性受抑制的物质，称为酶的抑制剂。近年来对酶抑制作用的研究进展迅速。由于通过酶抑制作用的研究，不仅对了解酶的专—性，酶活性部位的物理和化学结构，酶的动力学性质以及酶的作用机制等；而且对了解药物和毒物作用于机体的方式及机理等也有重要意义；对代谢途径中酶的调节也能提供信息。抑制剂之所以能抑制酶促反应，主要是由于它们能使酶的必需基因或活性部位的性质和结构发生改变，从而导致酶活性降低或丧失。按抑制剂作用的方式不同，酶的抑制作用可分为可逆和不可逆两种类型。一、可逆抑制作用按可逆抑制剂对酶—底结合的影响不同，可分为许多类型，它们的反应历程可用一通式表示：E+SKsESkpE+P+++IIEIEISSKiKiKs''速度方程通式根据此反应历程,根据快速平衡学说或恒态学说推导，得到其总速度方程通式如下在不同的抑制作用中，仅在于Ki和Ki’两个数值的不同，一般可分为4种类型：即竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制。max[][][](1)[](1)'VSvIIKsSKiKimax[][][](1)[](1)'VSvIIKmSKiKi将该方程作双倒数处理，可得1[]11[](1)(1)max[]max'kmIIvVKiSVKi1，竞争性抑制作用竞争性抑制作用中I只与自由酶结合，因而阻止S与酶结合。而S又不能与EI结合，I也不能与ES结合，所以EIS不存在；EI亦不能分解成产物。—个竞争性抑制剂只增加酶—底结合的表现Km(Kmapp)，即I浓度增加，Kmapp就增加；而Vmax则保持不变。在竞争性抑制剂存在下,要达到最大反应速度Vmax，必须加入更高的底物浓度。如[S]＞100Km时，Vmaxi可达Vmax。竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]，[S]，Km和Ki的大小。[I]一定，增加[S],减少抑制程度；[S]一定，增加[I]，增加抑制程度，Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大；Km值越低，在一定[S]、[I]下，抑制程度越小。竞争性抑制作用的双倒数图11[]1(1)max[]maxKmIvVSKiV竞争性抑制作用Ki的求解①从双倒数图计算出表观米氏常数Kmapp，然后代入Kmapp=Km(1+[I]/Ki)可计算出Ki。②从双倒数图求得各I浓度下的Kmapp值对相应[I]再作图，从再制图的纵截距可直接测得Km，从其横截距可直接测得Ki。③从不同固定[I]下所作一簇直线的斜率1/S对相应[I]再制图，其纵截距为Km/Vmax,斜率为Km/VmaxKi，横截距即为-Ki。④Dixon作图法求Ki11[](1)max[]max[]KmKmIvVKiSVS竞争性抑制剂的IC50值取决于实验所用的酶和底物浓度，当酶的浓度固定时，IC50值与Ki、Km和底物浓度[S]呈如下关系：根据该方程式，当底物浓度大于Km值时，IC50值高于Ki值，尤其当底物浓度较高时，Ki值偏低更加明显。50[](1)SICKiKm竞争性抑制剂的结构特征①底物类似物由于人们对一个酶所催化的底物性质了解的比较多，因此，常常利用酶的底物类似物作为竞争性抑制剂研究一些三维结构不清楚的酶活性中心的结构。另外，也可以根据底物的结构特点设计一些临床上使用的药物。例如，-葡糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖（voglibose）和米格列醇（Miglitol）黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，进而被氧化成尿酸，黄嘌呤氧化酶抑制剂-别嘌呤醇治疗痛风病就是通过抑制黄嘌呤氧化酶，降低尿酸的生物合成。②过渡态类似物酶催化化学反应效率高的原因在于酶能与高能态的过渡态相结合，从而大大降低了化学反应的活化能。如果对催化某一特定生物化学反应的酶的三维结构尚不清楚，可以根据其生化反应的过程，设计合成具有特定结构、疏水性匹配、电子和空间因素与过渡态类似的稳定化合物，作为该酶特异的抑制剂，这无疑为药物合理分子设计提供了另一强有力的手段。例如，乙酰胆碱酯酶(AChE)的羟基与酯酶的酯解部位形成共价键，其四价氮上的强正电荷与酯酶的阴离子部位呈静电联接。酶的乙酰化很快导致酯键断裂和胆碱的消除，乙酰化酶随即与水反应而使酶再生并放出乙酸。氨基甲酸酯杀虫剂是乙酰胆碱酯酶水解过渡态的稳定类似物，能与乙酰胆碱酯酶结合部位紧密结合而抑制乙酰胆碱酯酶。R3OCONR2R1氨基甲酸酯的基本结构NNCH3OCONCH3H毒扁豆碱OCONCH3CH3N+H3CH3CH3C新斯的明又如苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶的过渡态抑制剂，其结构类似底物苯甲酰苯丙氨酰化合物与酶形成的共价中间物中的底物酰基部分，比底物中的肽键羰基更易受到酶活性中心羟基的亲核进攻，但不能形成酰化酶共价中间物。③其它化合物有些化合物的平面结构与底物并不相似，但立体构象十分相近，也可以成为竞争性抑制剂。非甾体抗炎药是一类具有不同结构类型的化合物，由于选择性地抑制环氧合酶的活性，用作抗炎止痛药。环氧合酶抑制剂消炎痛和底物花生四烯酸的三维结构，整个分子的立体构象中，羧基和双键的配置有某种相似性，因而竞争性地与环氧合酶结合。塞来克西(Celebrex)作为环氧合酶（COX2，炎症细胞产生的酶）的特异性抑制剂，难以进入开口较小的COX1活性中心的通道，故而不能对其产生抑制作用，但仍能进入口径稍大，后段略有柔性的COX2通道，而能对COX2产生抑制作用。某些竞争性抑制剂的化学结构与底物的结构没有任何关系，其抑制作用的原理是抑制剂与一些酶活性中心的金属离子络合，妨碍了底物的进入，从而起到抑制酶活性的目的。例如5-脂氧合酶(LOX)的活性中心含有一个非血红素铁原子，通过Fe2+与Fe3+的循环实现其催化功能。该酶的某些抑制剂（CGS-23885,A-76745）就是通过铁的螯合而与底物竞争性地与酶活性中心结合。2，非竞争性抑制作用典型的非竞争性抑制剂不影响酶-底物结合；底物也不影响酶-I的结合；S和I都可可逆独立地结合于酶的不同部位上；并且ESI为端点复合物。非竞争性抑制作用的双倒数方程1[]11[](1)(1)max[]maxKmIIvVKiSVKi非竞争性抑制作用Ki的求解①从[I]＝0和[I]为某一固定浓度所作1/对1/[S]双倒数图的纵截距可直接测得1/Vmax和(1/Vmax)·(1+[I]/Ki)，从而计算出Ki。②从不同固定[I]所作双倒数图的斜率1/S对[I]再制图可求得Ki。③从不同固定[I]所作双曲数图的纵截距对[I]再制图，从其横截距可直接到得Ki。Dixon作图法求Ki11(1)[](1)max[]max[]KmKmKmIvVKiSVS非竞争性抑制剂的IC50值非竞争性抑制剂的IC50值与底物浓度的关系如下：根据该式，当底物浓度较高时，IC50值接近于Ki值；当底物浓度较低时，IC50值明显低于Ki值。50(1)[]KmICKiS非竞争性抑制剂的结构特征由于非竞争性抑制剂并非结合于酶活性中心的底物结合位点，而是活性中心附近的某些区域或基团，不影响酶与底物的亲和力。而非竞争性抑制剂的作用部位不是十分清楚，所以，不能根据酶的底物及酶活性中心的结构设计非竞争性抑制剂。目前所发现的一些酶的非竞争性抑制剂大多数都是随机筛选得到的化合物。例如，染料木素（genistein）对于-葡萄糖苷酶的抑制作用就是非竞争性抑制作用。他克林(tacrine)是治疗老年痴呆症的乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂。3，反竞争性抑制作用反竞争性抑制剂I不能与自由酶结合，而只能与ES可逆结合生成不能分解成产物的EIS。这一点与竞争性抑制相反，Ki值为∞，EIS只能解离成ES+I，而不能解离成EI+S。反竞争性抑制程度取决于[I]、[S]、Ki和Km等。它的抑制程度随底物浓度的增加而增加。反竞争性抑制剂使酶的Km值降低，即Kmapp＜Km。从这点看，反竞争性抑制剂不是一个抑制剂，而像是一个激活剂。它之所以造成对酶促反应的抑制作用，完全是由于它使Vmax降低而引起。所以如果[S]很小，反应主要为一级反应，则抑制剂对Vmax的影响几乎完全被对Km的相反影响所抵消。这时几乎看不到抑制作用。反竞争性抑制作用的双倒数方程111[](1)max[]maxKmIvVSVKi反竞争性抑制剂的结构特征反竞争性抑制在单底物酶催化反应中比较少见胎盘碱性磷酸酯酶以葡萄糖-6-磷酸或-萘酚磷酸酯为底物时，L-苯丙氨酸为反竞争性抑制剂；顺铂对乙酰胆碱酯酶的抑制作用也是属于反竞争类型。在双底物反应中，反竞争性抑制比较多见，如乒乓机制的酶促反应时，因为I可以与EB复合物结合，对一个底物（A）表现竞争性抑制的化合物（I）对另一个底物（B）呈现反竞争性抑制。如抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶的抑制作用，抗坏血酸相对于NADH表现为乳酸脱氢酶的反竞争抑制，相对于丙酮酸为乳酸脱氢酶的竞争性抑制剂。4，混合性抑制作用混合性抑制作用中S和E或EI都能够结合，I也可和E或ES结合，但亲和力都不相等，表明S和I对酶的结合互有影响，Ki和Ki’两者既不等于无穷大，又互不相等，Ksi和Ks’也不相等。有关可逆抑制作用的通式就是混合性抑制作用的公式。1[]11[](1)(1)max[]max'kmIIvVKiSVKi当用双倒数方程作图时，有抑制剂和无抑制剂的直线既不平行，又不相交于纵轴或横轴，而是相交于横轴负侧的上方（第二象限）或下方（第三象限）二、不可逆抑制作用这类抑制作用的抑制剂与酶分子上的某基团以牢固的共价健结合使酶失活。不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制。1，非专一性不可逆抑制作用(1)酰化剂可用通式表示为RCOX。例如，醋酸酐、三氟乙酸硫醇酯、乙酰咪唑等。它们对酶的酰化反应如下式：磷酰化剂亦属此类，如二异丙氟磷酸酯(DFP)以及1605、1059等有机磷酸农药以及神经毒剂。DFP能使乙酰胆碱酯酶分子中的一个丝氨酸侧链(Ser-CH2OH)磷酸化而使酶失活。(2)烃基化剂可用通式R-X表示。如卤烃衍生物，由于卤原子的强电负性，使烃基带部分正电荷，有利于酶上一些亲核基团的攻击，反应如下式：(3)含活泼双键的试剂含活泼双键的试剂，如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等，它们可与酶分子上的-SH、-NH2等基团起加成反应，如下式：(4)亲电试剂常见的有四硝基甲烷，它可使酶分子上的酪氨酸侧链硝基化。产物具有特殊光谱性质，易于被检测。反应如下式：2，指向活性部位抑制剂指向活性部位抑制剂的作用特征是,抑制剂分子中含有化学活泼的功能基，它与酶的活性部位处的基团或原子发生共价结合，使酶失活。这类抑制剂通常是在物物分子所特有的识别基团上连接或修饰有反应活性的化学基团或原子，当抑制剂与酶形成初始的可逆性的复合物后，该反应活性功能基与酶活性中心发生化学反应，形成共价键，以致改变了酶的氨基酸的残基的排布(构象)而失活引入的化学活性基团有卤代酰基，卤代酮、偶氮岭甲基酮、环氧基、亚磺酰氟、不饱和键、二硫键、光敏基团等。这类抑制剂与酶的反应速率应比类似的非酶性反应快，例如