DB13T 1420-2011 马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程

ICS65.020.20B05DB13河北省地方标准DB13/T1420—2011马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程TechnologicalrulesfordetectingfungicideresistanceinPhytophthorainfestansonpotato2011-07-07发布2011-07-17实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1420—2011I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准河北省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：河北省农林科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：王文桥、张小风、马志强、韩秀英、孟润杰、赵建江。DB13/T1420—20111马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程1范围本标准规定了马铃薯晚疫病菌抗药性检测的术语和定义及检测方法。本标准适用于马铃薯晚疫病菌对杀菌剂的抗性检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1抗药性fungicideresistance一种杀菌剂当用其标签推荐的剂量防治作物病害时，即使重复试验也无法达到所期望的防治效果，该靶标病菌群体的敏感性下降的遗传变化称为抗药性。2.2敏感基线sensitivitybaseline：在同类作用方式的杀菌剂使用之前，靶标病菌群体中不同菌株对一种药剂的敏感性(EC50值)分布曲线，常用平均值及95%置信限表示。2.3敏感型sensitivitytype：根据菌株对药剂的敏感性(EC50值)或抗性水平，或在区分剂量下药剂对菌株的抑制程度，将菌株划分成敏感、低抗、中抗、高抗等不同类型。2.4菌丝生长速率法马铃薯晚疫病菌菌丝体在含药培养基平板上培养而生长受到抑制的毒力测定方法，适用于检测马铃薯晚疫病菌对能显著抑制其菌丝生长的苯基酰胺类、QoI类、羧酸酰胺类、乙酰胺类、氨基甲酸酯类、苯甲酰胺类等杀菌剂的抗药性。2.5叶盘漂浮法马铃薯晚疫病菌孢子囊接触漂浮于药液上的叶盘背面而萌发受到抑制的毒力测定方法，适用于马铃薯晚疫病菌对具有内吸性的苯基酰胺类、QoI类、羧酸酰胺类、乙酰胺类、氨基甲酸酯类、苯甲酰胺类等杀菌剂的抗药性检测。3测定方法3.1菌丝生长速率法适用于检测马铃薯晚疫病菌对能明显抑制其菌丝生长的甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺、代森锰锌、百菌清及其混剂的抗性。DB13/T1420—201123.1.1供试菌株的采集、分离及保存田间采集感染晚疫病的马铃薯新鲜叶片，夹入洗净蘸干的马铃薯块茎中，做好标记，带回实验室，16~18℃培养2～3d。在无菌条件下，将块茎上霉状物用接种针挑至含100µg/mL氨苄青霉素、20µg/mL利福平及100µg/mL五氯硝基苯的黑麦琼脂培养基(Ryeagar,RA)平板上，18~20℃培养4~5d，将未受杂菌污染的菌丝转接到新的RA平板上，18~20℃培养7～10d后转至试管中RA斜面上，培养至菌丝长满，在10℃条件下保存，每3个月转接1次。3.1.2供试药剂的收集及保存收集杀菌剂原药，保存于避光、低温（0-4℃）及干燥条件下。3.1.3含药培养基的制作称取适量的原药，用有机溶剂（如丙酮、二甲亚砜等）溶解，以无菌水稀释成母液（丙酮含量应低于总体积的1%），再加入无菌水稀释成系列浓度的药液，按照药液与培养基体积比1:9分别加入溶化的RA中，混匀，泼碟，配制成含不同浓度药剂的RA平板。对照仅加入适量DMSO或丙酮等溶剂。3.1.4接种及培养将菌株在RA平板上培养10d，从菌落边缘以直径0.5cm打孔器打菌饼，用接种针挑取菌饼接在含药RA平板（直径9cm)中央，以不含药RA平板为对照，每皿接1个菌饼，每处理重复3次。盖上皿盖，18-20℃培养10d。3.1.5结果检查待对照菌落长至直径约7cm后，用直尺十字交叉测量菌落直径(cm)2次，计算平均值。3.1.6数据统计和分析按下式计算各处理（不同浓度的药剂）对菌丝生长的抑制率，结果保留到小数点后两位。P=5.0010−−DDD×100…………………………………………………(1)式中：P为抑制率（％）；D0为对照菌落直径（cm）；D1为处理菌落直径（cm）。采用SAS、DPS等统计软件，进行药剂浓度对数值（X）与抑制率的几率值（Y）之间的线性回归分析，求出每种药剂对每个菌株的毒力回归方程式（Y=a+bX）、相关系数和置信限。由毒力回归方程式求出菌株对药剂的敏感性(EC50值)。3.1.7敏感基线(EC50)的建立从未使用过某种药剂及其相同作用机理药剂的地区采集分离约100株马铃薯晚疫病菌，测其对该药的敏感性(EC50值)。将供试菌株对某种药剂的敏感性(EC50值)划分成不同区段（一般5个区段），确定敏感性分布范围（例如从较小的a到较大的b)，写出浓度区段（等差数列）a,a+（b-a）/n,a+2（b-a）/n,a+3（b-a）/n,a+4（b-a）/n,……,a+(k-1)×（b-a）/n（n为区段数，k为数列的序数），以每个区段菌株出现频率（%）为纵轴，以药剂浓度区段为横轴，画出敏感性分布光滑曲线图，由n个点连成，每一点以(x,y)来表示，x=浓度区段中值，y代表该区段菌株出现频率。利用DPS、SPSS等统计软件进行敏感性数据正态性分布检验，如果Ρ值0.05，即在95%置信限内，敏感性呈近似正态分布，则菌株可视为野生敏感菌株，其敏感性(EC50值)平均值可作为敏感基线(EC50值)，计算结果保留3位有效数字。基线数据参照附录A。DB13/T1420—201133.1.8抗性水平评估抗性水平＝值）敏感基线（值）敏感性（5050ECEC×100．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．（２）计算结果保留整数。3.1.9菌株敏感型划分菌株对甲霜灵（或精甲霜灵）敏感型：高抗菌株：在含5µg/mL、100µg/mL甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径≥对照菌落直径的40﹪；中抗菌株：在含5µg/mL甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径＞40%对照菌落直径，在含100µg/mL甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径＜对照菌落直径的40%；敏感菌株：在含5µg/mL、100µg/mL甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径均＜对照菌落直径的40﹪。菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁霜灵等高度固有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50值）≤敏感基线的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)；低抗菌株（LR），(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)抗性水平≤100倍；中抗菌株（MR），100倍抗性水平≤500倍；高抗菌株（HR），抗性水平500倍。菌株对霜脲氰、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜霉威、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低度固有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50值）≤敏感基线的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)；低抗菌株（LR），(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)抗性水平≤10倍；中抗菌株（MR），10倍抗性水平≤100倍；高抗菌株（HR），抗性水平100倍。3.1.10抗性频率评估抗性频率（%）=供试菌株数抗性菌株数×100……………………………………（3）计算结果保留至小数点后一位。3.1.11检测报告的编写根据统计结果、抗性水平及抗性频率评估，写出正式抗性检测报告，并列出原始数据。3.2叶盘漂浮法适用于检测马铃薯晚疫病菌对甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等内吸杀菌剂及其混剂的抗性。3.2.1供试菌株的采集、分离及保存同3.1.13.2.2孢子囊悬浮液的配制将保存在试管中RA斜面上的菌株转接至薯片上培养，将霉状物用适量无菌水冲洗，或将适量无菌水加入培养菌株10～15d的RA平板上，用刮板刮取菌落中的孢子囊，用2层纱布过滤，离心，以无菌水稀释，制备5×104孢子囊/mL的孢子囊悬浮液，4℃保存2.5h，备用。3.2.3供试药剂的收集、保存及配制收集甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、DB13/T1420—20114霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等杀菌剂原药。保存在避光、低温（0-4℃）干燥条件下。实验时，称取适量的原药，加入少量丙酮或二甲亚砜（DMSO）等有机溶剂溶解，再加入无菌水稀释成母液，将母液以无菌水稀释成系列浓度的药液。3.2.4供试植株在花盆中或日光温室土壤中种植马铃薯感病品种（费乌瑞它、夏坡蒂等），待长至7-8片复叶时，取叶片用打孔器打成直径1.5cm叶盘待用。3.2.5接种及培养每个直径9cm的培养皿中加入20mL药液（对照加蒸馏水），每浓度1皿，将15片叶盘背面向上漂浮在液面上。用微量移液器在每叶盘背面点接1滴10μL的孢子囊悬浮液。在每天光照16h18～20℃的条件下培养4～5d。3.2.6调查发病待对照充分发病后调查每片叶盘产孢情况。根据产孢面积占叶盘面积的百分率划分病级：0级，无病；1级，1%～5%；3级，6%～10%；5级，11%～20%；7级，21%～50%；9级，＞50%。3.2.7数据统计和分析按下式计算各处理病情指数和相对防效，结果保留到小数点后两位。病情指数＝最大病级数总叶盘数相应病级数）病叶盘数×∑×(×100………………………………………….(4)相对防效（%）＝对照病情指数处理病情指数对照病情指数−×100……………………..(5)按照3.1.6所述方法统计出菌株对药剂的敏感性(EC50值)。3.2.8敏感基线(EC50值)的建立同3.1.73.2.9抗性水平评估同3.1.83.2.10菌株敏感型划分对甲霜灵或精甲霜灵敏感型：高抗菌株，EC50值＞10µg/mL；中抗菌株，EC50值为0.01～10µg/mL；敏感菌株，EC50值＜0.01µg/mL。对嘧菌酯、噁霜灵、吡唑醚菌酯等高度固有抗性风险药剂的敏感型划分同3.1.9。对霜脲氰、烯酰吗啉、氟吗啉等低中度固有抗性风险药剂的敏感型划分同3.1.9。3.2.11抗性频率评估同3.1.103.2.12检测报告的编写根据统计结果、抗性水平及抗性频率评估，写出正式抗性检测报告，并列出原始数据。DB13/T1420—20115附录A（资料性附录）马铃薯晚疫病菌敏感基线表A.1马铃薯晚疫病菌对不同杀菌剂的敏感基线（EC50值）数据药剂EC50值（µg/mL）菌落生长速率法叶盘漂浮法甲霜灵metalaxyl0.0052±0.00240.0660±0.0183精甲霜灵mefenoxam0.0027±0.00120.0325±0.0121噁霜灵oxadixyl0.0076±0.00300.3105±0.1070烯酰吗啉dimethomorph0.0634±0.02250.2033±0.0965氟吗啉flumorph0.0569±0.02290.3530±0.1320双炔酰菌胺mandipropamid0.2006±0.06170.3106±0.1337霜脲氰cymoxanil0.3375±0.11190.4108±0.2010嘧菌酯azoxystrobin——0.2161±0.0893吡唑醚菌酯pyraclostrobin——0.3066±0.1011唑胺菌酯pyrametostrobin——0.4531±0.2332氟吡菌胺fluopicolide0.1154±0.03440.4670±0.2005_________________________________