DB21T 1861.2-2010 水产生物种质检验技术规程 扩增片段长度多态性法

ICS 67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.2—2010水产生物种质检验技术规程扩增片段长度多态性法AFLPproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.2 —2010I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：刘卫东、高祥刚、赫崇波、李云峰、李宏俊、鲍相渤。附录A、B、C均为资料性附录。DB21/T1861.2 —20101扩增片段长度多态性法     扩增片段长度多态性法1范围本标准规定了水产生物扩增片段长度多态性分析（AFLP）的原理、试剂、仪器和设备、采样、分析步骤和数据运算方法。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.15-2008养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2基因型（Genotype）控制某一性状的基因组合。3.3座位（Locus）基因在染色体上所处的特定位置。3.4等位基因（Allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.5多态性位点百分率(PercentofPolymaorphicLoci，P)表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.6Nei’s基因多样性指数（GeneDiversity，H）随机选择基因间的非同一的概率。3.7遗传距离（GeneticDistance，D）DB21/T1861.2 —20102用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。3.8Shannon多样性指数(Shannonindex，I)用来估算群落多样性的高低。3.9聚类分析（ClusterAnalysis）将研究对象分为相对同质的群组（clusters）的统计分析技术。4原理扩增片段长度多态性法（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）的原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增，先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段，并与含有粘性末端的人工接头相连，形成酶切位点不同的限制性酶切片段，然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增，预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态。5试剂5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇：分析纯。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA7.44g，加超纯水到1L。5.6冰乙酸：分析纯。5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9蛋白酶K（20mg/mL）：生化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.13硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16TaqDNA聚合酶（生化试剂，5U/L）。5.17标准分子量Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）：分析纯。DB21/T1861.2 —201035.21限制性内切酶：EcoRⅠ、MseⅠ。5.2220%变性凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g，尿素86g，20×TBE缓冲液10mL，加热溶解，超纯水定容到200mL后，用0.25μm的微孔滤膜抽滤，放置棕色瓶中4℃保存。5.23上样缓冲液：98％甲酰胺，10mMEDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。5.240.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）溶于100ml超纯水中。5.25银染液：1g硝酸银溶于1L超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml。5.26显影液：3g碳酸钠溶于超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸钠150μl。6仪器和设备6.1凝胶成像分析系统。6.2梯度PCR仪。6.3低温高速离心机。6.4普通离心机。6.5稳压稳流电泳仪。6.6单道可调移液器（2.5L，10L，20L，100L，200L，1000L）。6.7电子天平（量程0.01-300mg）。6.8水浴恒温震荡器。6.9电泳槽。6.10冷冻离心机。6.11紫外分光光度计。6.12超声波清洗器。6.13超纯水器。6.14北京六一仪器厂DYY-Ⅲ型电泳仪。6.15测序凝胶电泳槽。7采样7.1样品类型7.1.1I型样品：毛发、皮毛类（儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟）。7.1.2Ⅱ型样品：肌肉、脏器组织类（仿刺参、海胆、虹鳟、大菱鲆、鳗鲡、中国对虾、日本对虾、中华绒鳌蟹、三疣梭子蟹、皱纹盘鲍、海湾扇贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝、文蛤、牡蛎、海蜇等）。7.1.3III型样品：藻类（海带、裙带菜、鼠尾藻等）。7.2采样方法7.2.1珍稀濒危动物采样应在自然保护机构、人工养殖部门等协助下进行，以不伤害个体、不破坏其生境为原则，采集其毛发、皮毛等作为样品，特殊情况（如出现受伤个体等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝脏等）。样品数量应不少于10个/群体。所采样品标注后，妥善存放，防止污损，做好采样记录。DB21/T1861.2 —201047.2.2重要水产生物采样随机采取正常、健康个体样品，数量不少于30个/群体。样品标注后，活体运至实验室。8分析步骤8.1样品固定8.1.1Ⅰ型样品将样品先用70%乙醇洗1次，再用超纯水冲洗2次，-20℃保存备用。8.1.2Ⅱ型样品从活体中直接采集肌肉或脏器组织，-20℃冰箱直接冻存。8.1.3Ⅲ型样品选取幼嫩藻尖，用毛笔在无菌海水中充分刷洗，解剖镜下观察，确定没有附生杂藻后，在无菌蒸馏水中清洗，晾干备用。8.2DNA提取8.2.1Ⅰ型样品在200μL离心管中放入1~4根毛发，毛囊置于离心管底部，剪去高于离心管部分的毛发，设置一个空白对照管；在每个离心管中加入15μL配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1×PCR缓冲液(50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl，0.01%明胶)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K20mg/L；在PCR仪上设置一个单循环程序：65℃30min，95℃15min，4℃10min；将上一步骤中的离心管放入预热好的PCR仪中，运行该程序。程序结束后，将离心管进行瞬时离心，-20℃保存备用。8.2.2Ⅱ型样品取-20℃下冻存的肌肉或脏器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5%SDS，5mmol/LEDTA)。振荡均匀后，65℃水浴1h；按GB/T18654.15-2008的规定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用50µLTE缓冲液（10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA）溶解DNA，-20℃保存。8.2.3Ⅲ型样品取鲜样品50～150mg，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品完全冷冻后，快速、用力研磨至粉末状；将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化，向研钵中加入DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5％SDS，5mmol/LEDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400μL，用力碾磨30s。收集研磨好的组织匀浆移至1.5mL离心管中，65℃保温15~60min，按GBT18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍体积醋酸钠(3mol/L，pH5.2)和两倍体积无水乙醇沉淀；溶于50µLTE缓冲液(10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA)，置-20℃保存备用。8.3DNA产物测定DB21/T1861.2 —201058.3.1DNA纯度检测吸取1~3µL提取的DNA，用浓度1~2％琼脂糖凝胶100V电泳30min，检测所提取DNA的质量。以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。8.3.2DNA浓度检测8.3.2.1紫外吸收定性测试分别于260nm波长和280nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在1.8~2.0范围内，方可正常进行后续实验。8.3.2.2紫外吸收定量测试260nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值，根据公式计算DNA浓度。DNA浓度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀释倍数，公式中的A260表示被测样品在260nm波长下的吸光度值，L为比色池厚度，单位是cm。应保证DNA浓度在10μg/mL以上，方可正常进行后续实验。基因组DNA产物完成产物鉴定后，稀释到100ng/µL备用。8.4AFLP分析8.4.1限制性内切酶消化本规程统一采用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切组合反应体系。按表1配制酶切体系，每40µL体系中加入DNA10µL，37℃保温3h，65℃保温3h。表1限制性内切酶消化反应体系试剂原始浓度最终浓度体积（µL）酶切缓冲液10X1X5.0EcoRⅠ10U/µl5U0.5MseⅠ4U/µl5U1.25乙酰化牛血清白蛋白10µg/µl5µg0.5超纯水————32.75基因组DNA50ng/µl——10µl总计————50µl8.4.2接头复性将EcoRⅠ和MseⅠ各自的单链接头等分子数混合，94℃变性3min，37℃保温5min。接头序列见附录A8.4.3接头连接（冰上操作）按表2配制连接体系，混匀，室温下连接过夜。表2接头连接反应体系试剂体积（µL）基因组DNA酶切液5.0EcoRⅠ接头(2PM/µL)1.0DB21/T1861.2 —20106MseⅠ接头(2PM/µL)1.0T4DNA连接酶10X缓冲液2.0T4DNA连接酶(3U/µL)0.1AcetylatedBSA0.02超纯水10.88总计20.08.4.4预扩增预扩增引物序列见附录B。按表3配制预扩增体系，按表4进行PCR反应。表3预扩增反应体系试剂体积(µL)EcoRⅠ预扩增引物(50ng/µl)1.2MseⅠ预扩增引物(50ng/µl)1.2dNTPs(5mM)0.810XPCR缓冲液2.0Taq酶(5U/µl)0.2MgCl2(25mM)1.6超纯水11.0接头连接液2.0总计20.0表4预扩增反应条件94℃（初始变性）2min94℃（变性）1min56℃（退火）1min.72℃（延伸）1min.26个循环72℃（终了延伸）5min.8.4.5选择扩增选择扩增引物序列见附录C，将预扩增产物稀释10-100倍作为选扩增模板，按表5配制选扩增体系，按表6进行PCR反应。表5选择扩增反应体系试剂体积(µL)EcoRⅠ选择扩增引物(50ng/µl)1.2MseⅠ选择扩增引物(50ng/µl)1.2dNTPs(