NYT 1103.3-2006 转基因植物及其产品食用安全检测 抗营养素 第3部分 硫代葡萄糖苷的测

NY中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.3—2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分：硫代葡萄糖苷的测定SafetyassessmentofgeneticallymodifiedplantandderivedproductsPart3:assayofanti-nutrientsglycosinolate2006-07-10发布2006-10-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T1103.3—2006前言本标准附录A为资料性附录，附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人：李培武、杨月欣、丁小霞、韩军花、张文、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。本标准首次发布。NY/T1103.3—2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分：硫代葡萄糖苷的测定1范围本标准规定了转基因油菜籽及其产品中硫代葡萄糖苷的高效液相色谱测定方法。本标准适用于转基因油菜籽及其产品中硫代葡萄糖苷的高效液相色谱测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T14488.1油料种籽含油量测定法GB/T14489.1油料水分及挥发物含量测定法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1转基因油菜籽geneticallymodifiedrapeseed指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的油菜籽。3.2转基因油菜籽产品productsderivedfromgeneticallymodifiedrapeseed指转基因油菜籽的直接加工产品和含有转基因油菜籽的产品。3.3相对校正系数responsefactors待测硫代葡萄糖苷的摩尔吸光系数与内标的摩尔吸光系数的相对比值。4原理NY/T1103.3—2006用70%甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，然后在阴离子交换树脂上纯化，并酶解脱去硫酸根，反相色谱柱分离，紫外检测器检测硫代葡萄糖苷。5试验材料转基因油菜籽及其产品、受体油菜籽及其产品。如果对转基因油菜籽产品中的硫代葡萄糖苷进行测定，转基因油菜籽产品和受体油菜籽产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。6试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂；水为蒸馏水。6.1硫酸酯酶溶液：HelixpomatiaH1型（EC3.1.6.1），每毫升硫酸酯酶溶液的活性单位不低于0.5，硫酸酯酶溶液应即配即用。6.2葡聚糖凝胶悬浮液：称取10gDEAESephadexA25葡聚糖凝胶，浸泡在过量的2mol/L醋酸溶液中，静置沉淀，再加入2mol/L醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的2倍，于4℃冰箱中存放，待用。6.370%甲醇溶液：取70mL甲醇，加水定容至100mL。6.40.02mol/L醋酸钠溶液：称取0.272g醋酸钠（CH3COONa·3H2O），加入800mL水溶解，用醋酸调节溶液的pH值至4.0，加水定容至1L。6.56mol/L甲酸咪唑溶液：称取204g咪唑，溶解于113mL甲酸中，待溶液冷却后加水定容至500mL。6.6内标：用丙烯基硫代葡萄糖苷（Mr=415.49）作内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷时，用苯甲基硫代葡萄糖苷（Mr=447.52）作内标。对硫代葡萄糖苷含量低于20.0μmol/g的样品，可将下述6.6.1至6.6.4中的内标溶液浓度降为1mmol/L至3mmol/L。内标溶液在4℃的冰箱中可存放三周，在-18℃条件下可保存更长时间，内标溶液的纯度检定见附录A。6.6.15mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取207.7mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.220mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取831.0mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.35mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.420mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。NY/T1103.3—20066.7流动相A：超声波脱气30s的水。6.8流动相B：取200mL色谱级乙腈，加入800mL水，浑匀，超声波脱气30s。7仪器和设备7.1通常实验室仪器设备。7.2研钵或微型研磨机。7.3聚丙烯离子交换微柱：底部筛板为100目。7.4离心机：带有10mL转头，并能获得5000g的相对离心力。7.50.45μm水溶性微孔滤膜。7.6色谱柱：填料颗粒小于或等于10μm的反相C18或C8柱，例如：NovapakC18柱，5μm（150mm×3.9mm）；LichrosorbRp18柱，5μm（150mm×4.6mm）；SpherisorbC18柱，10μm（150mm×4mm）；LichrospherRp8柱，5μm（125mm×4mm）。7.7高效液相色谱仪：具备梯度洗脱，柱温可控制在30℃，带紫外检测器。8试样的制备按照GB5491的规定对试验材料进行缩分，将缩分后的试验材料分成三等份。第一份按GB/T14489.1的规定测定水分及挥发物含量，第二份按GB/T14488.1的规定测定含油量，第三份为硫代葡萄糖苷待测试样。如果试验材料的水分及挥发物含量超过10%，应在45℃条件下通风干燥，并将干燥后的待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成9.1和9.2。9操作步骤9.1称样分别称取200.0mg待测试样至A、B两支离心管中。9.2硫代葡萄糖苷的提取9.2.1将离心管75℃水浴1min，加入2mL70％沸甲醇溶液后，立即加入200μL5mmol/L内标溶液至A管中，200μL20mmol/L内标溶液至B管中。9.2.275℃水浴10min，其间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，5000g离心3min，分别转移上清液至10mL刻度试管A＇、B＇中。9.2.3分别向A、B管中再加入2mL70％沸甲醇溶液，75℃水浴约30s，旋涡混匀后，75℃水浴10min，其间每隔2min取出离心管旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，5000gNY/T1103.3—2006离心3min，分别转移上清液至原刻度试管A＇、B＇中。9.2.4用水调节A＇、B＇管中的提取液至5mL，混匀。此提取液在-18℃暗处可保存2周。9.3离子交换微柱的制备每一个试样提取液准备一支聚丙烯离子交换微柱，垂直置于试管架上。取0.5mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换微柱中，注意不要使悬浮液粘附在柱壁。静置待液体排干后，取2mL6mol/L甲酸咪唑溶液冲洗树脂，排干后，再用1mL水冲洗树脂两次，每次均让水排干。9.4纯化、脱硫酸根9.4.1取1mL提取液缓缓加入已制备好的离子交换微柱中，注意不能搅动树脂表面，待液体排干后，分别加入1mL0.02mol/L醋酸钠溶液两次，每次加入后均让液体排干。9.4.2加入100μL硫酸酯酶溶液至离子交换微柱，35℃条件下反应16h。9.4.3分别用1mL水冲洗离子交换微柱2次，洗脱液收集于试管中。9.4.4用水将洗脱液定容至5mL，充分混匀后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，待进样。洗脱液在-18℃暗处可存放1周。9.5空白试验用相同的样品进行相同的前处理，但不加内标物质，以检定样品中内标物质是否存在。9.6色谱条件9.6.1仪器条件：流动相流速为1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测器检测波长229nm。9.6.2洗脱梯度9.6.2.1对SpherisorbC18柱，10μm（150mm×4mm）和NovapakC18柱，5μm（150mm×3.9mm），洗脱梯度见表1。表1SpherisorbC18柱和NovapakC18柱洗脱梯度时间流动相A（％）流动相B（％）0min158510min100012min100015min158520min15859.6.2.2对LichrosorbRP18柱，5μm（150mm×4.6mm），洗脱梯度见表2。NY/T1103.3—2006表2LichrosorbRP18柱洗脱梯度时间流动相A（％）流动相B（％）0min10001min100020min010025min100030min10009.6.2.3对LichrospherRP8柱，5μm（125mm×4mm），洗脱梯度见表3。表3LichrospherRP8柱洗脱梯度时间流动相A（％）流动相B（％）0min10002.5min100020min010025min010027min100032min10009.7色谱测定进样量10μL，记录峰面积。10结果表示10.1单组分硫代葡萄糖苷含量的计算10.1.1以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，按式（1）计算：D1=wKgmnAsAg−×××11…………………………………………（1）式中：D1－干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微摩尔每克（μmol/g）；Ag—脱硫硫代葡萄糖苷峰面积；As—内标峰面积；Kg—脱硫硫代葡萄糖苷相对校正系数，见附录B；NY/T1103.3—2006m—试样质量，单位为克（g）；n—试样中加入内标的量，单位为微摩尔（μmol）；w—试样中水分、挥发物和含油量之和，以质量百分数表示（％）。计算结果表示到小数点后两位。10.1.2以每克脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，按式（2）计算：D2=)1(11WswKgmnAsAg−×−×××…………………………（2）式中：Ag、As、n、m、Kg、w同式（1）；D2－脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖苷的含量，单位为微摩尔每克（μmol/g）；Ws—标准水分及挥发物含量，以质量百分数表示，数值为8.5％或9％。计算结果表示到小数点后两位。10.1.3以每克干基油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，按式（3）计算：D3=wtKgmnAsAg−×××11………………………………………（3）式中：Ag、As、n、m、Kg同式（1）；D3－干基油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微摩尔每克（μmol/g）；Wt—试样中水分及挥发物含量，以质量百分数表示（％）。计算结果表示到小数点后两位。10.1.4以每克油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，按式（4）计算：D4=)1(11WswtKgmnAsAg−×−×××…………………………（4）式中：Ag、As、n、m、Kg、wt、Ws同式（1）、（2）和（3）；D4—油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖苷的含量，单位为微摩尔每克（μmol/g）。NY/T1103.3—2006计算结果表示到小数点后两位。10.2硫代葡萄糖苷含量的计算硫代葡萄糖苷含量等于单组分硫代葡萄糖苷（单组分峰面积应大于峰面积总和的1%）含量的总和，以每克样品中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示。如果A、B两管硫代葡萄糖苷含量的测定值满足11中允许差的要求，硫代葡萄糖苷的含量为两测定值的算术平均值。计算结果表示到小数点后两位。11允许差11.1同一试样、同一方法、同一操作者、同一仪器、同一实验室短期内两次测定值允许差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00μmol/g，允许差不大于2.00μmol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00μmol/g－35.00μmol/g范围内，允许差不大于4.00μmol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00μmol/g