细胞mRNA的提取

技术方法名称细胞mRNA的提取基本原理一个典型的哺乳动物细胞含有约10-5ug总RNA，其中80～85%是核糖体RNA（主要有28S，18S，5.8S和5S四种）。剩余的15～20%中大部分由不同的低相对分子量的RNA组成（如转运RNA和小核RNA）。这些高丰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1～5%的信使RNA即mRNA无论大小还是序列都是相异，其长度从几百碱基到几千碱基不等，其实际含量也随着细胞类型的不同而不同，随细胞生理状态的变化而变化。在单个哺乳动物细胞中，大约有360,000个mRNA分子，12,000种不同的mRNA分子。有些mRNA在mRNA群体中的比例约为3%，而其它一些mRNA所占的比例则不超过0.01%。这些稀有或低丰度mRNA的拷贝数大约是每个细胞5～15个。然而，这些低丰度mRNA有11,000种，占mRNA群体的45%。在真核生物中，大部分mRNA（组蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其约200个腺苷酸残基构成的3’尾部为分离真核mRNA提供了有效的方法。寡聚（dT）可以与poly（A）尾相结合，被用于回收mRNA。传统方法是将提取的总RNA（用酚-氯仿抽提细胞裂解液）通过寡聚（dT）纤维素柱来制备。但为了能将核酸酶造成的损伤降至最低，现在常采用一种更迅速的方法即直接将结合着寡聚（dT）的磁珠加入到细胞裂解液中，再用强磁铁将磁珠吸出再洗出mRNA。某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物可以作为mRNA提取的替换途径。因为核糖残基在2’和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶—具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。由于RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，故要小心防止玻璃器皿、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被缓冲液中加入的EDTI或其他金属离子螯合剂失活。防止RNA酶最好的方法就是避免污染。提取细胞mRNA后，可通过mRNA翻译、凝胶电泳或NorthernBlot分析来检测mRNA的完整性，通过紫外分光光度计来检测mRNA的纯度。用途及受限因素■酶学研究■cDNA文库构建■RT-PCR■S1核酶分析■引物扩增■核糖核酸酶保护■分子杂交■体外转录■差异显示■基因表达分析mRNA在细胞总RNA中的比例很低，需要大量的样本用于mRNA的提取，这就大大限制了稀有样本的检测。细胞mRNA的提取—以Promega公司的PolyATtractSystem1000为例基本原理任何一种RNA提取方法都包括以下四个步骤：1）高效裂解细胞或组织；2）变性核蛋白复合物；3）灭活内源性的RNase活性；4）纯化RNA。所有这些步骤中最重要的是，立即灭活细胞裂解后从膜包围的细胞器中释放出的内源性RNase。用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。PolyATtract®System1000利用硫氰酸胍（GTC）和β-巯基乙醇来灭活细胞抽提液中的核酸酶，利用GTC和SDS来变性核蛋白复合物。核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来，使得RNA从溶液中释放出来，并与蛋白质分离。最终GTC的浓度允许mRNA的poly(A)与合成的生物素化的Oligo(dT)探针退火，但仍能完全抑制细胞内的RNases。短暂的离心完成杂交，并去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。离心后，用StreptavidinMagneSphere®ParamagneticParticles(SA-PMPs)来捕获生物素化的Oligo(dT):mRNA杂交分子。先用高严谨性的条件洗涤磁珠，然后用Nuclease-FreeWater洗脱，便可获得纯化的mRNA。实验材料实验耗材细胞刮子、微量移液器、量筒、烧杯、盐水瓶、止血钳、锡箔纸、药勺；进口Tip、Tube试剂NaAc、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、无水乙醇、异丙醇等，均为分析纯，且最好是新的未开封的；DEPC，焦碳酸二乙酯，购自Invitrogen公司；PolyATtractSystem1000，Cat#Z5400购自Promega公司。实验前的准备（包括溶液的配制及无RNAase和DNAase环境的建立）1.无RNAase和DNAase环境的建立玻璃制品、铁制品、塑料制品和电泳槽无菌的一次性使用的塑料制品（进口）基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。但为了保险起见，将它们装入无RNase和DNase的铁饭盒（干烤：300℃，4h），加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡，37℃，至少2h，或室温下过夜。随后，高压蒸汽灭菌，15psi（1.05kg/cm2），15min。再烘干，100℃，2～3h。实验室用的普通玻璃器皿、铁制品和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于300℃干烤4h或更长时间（玻璃器皿、铁制品，若是敞口的器皿，需用锡箔纸封口后再干烤）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15min。在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15min。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10min，然后用0.1％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。附DEPCDEPC是具有高度活性的烷基化试剂，它通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase的酶活性。虽然DEPC是RNase的强烈抑制剂，但是它的作用并不是绝对的。在水溶液中，DEPC迅速水解为CO2和乙醇，在pH6.0的磷酸缓冲液中半衰期为20min，在pH为7.0的磷酸缓冲液中为10min。这种水解过程通过Tris和其它胺类大大加速，它们自己本身也在这一过程中消耗了。因此，DEPC不能用来处理含有这些缓冲液的溶液。无亲核体（例如：水和乙醇）的DEPC样品是非常稳定的，但是甚至小量的上述溶质也能导致DEPC完全转化成碳酸二乙酯。由于这个原因，DEPC应该防潮，并小份储存于干燥的条件下，在开启瓶子前，应该使瓶子达到足够的温度。溶液的处理用干烤过的药匙称取试剂，用DEPC处理过的无菌去离子水溶解和稀释试剂，将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话，溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12h，然后于100℃加热15min或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15min。DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。操作者及其操作环境RNase最主要的潜在污染源是操作者和灰尘。操作者应该戴一次性手套，并勤换手套；应该戴口罩和帽子，尽量不要对着RNA样品呼气或说话。灰尘中含有细菌和霉菌，所以应该保持操作环境整洁。对于多次使用的试剂，最好无菌操作。2.溶液的配制无DNase和RNase的去离子水将新鲜制备的去离子水装入干烤过的盐水瓶，加入DEPC，使其终浓度达到0.1%，振荡混匀后，置于37℃过夜。高压蒸汽蒸汽灭菌，15lbf/in2(1.034x105Pa)，15min。3M醋酸钠溶液（100ml）NaAc•3H2O40.81g新鲜制备的去离子水80ml搅拌溶解后，用冰乙酸调pH至5.2，约需1.85ml，再加去离子水调至100ml。加入100ulDEPC，振荡混匀后置于37℃过夜，然后高压蒸汽灭菌，15lbf/in2(1.034x105Pa)，15min。PBS（200ml）NaCl16gKCl0.4gNa2HPO4·12H2O7.26gKH2PO40.48g用160mlDEPC处理过的无菌去离子水溶解上述试剂，用浓HCl调pH至pH7.4，再用DEPC处理过的无菌去离子水定容至200ml。高压蒸汽灭菌，15lbf/in2(1.034x105Pa)，15min。70%乙醇采用DEPC处理过的无菌去离子水配制。无血清培养基1640实验设计可以根据起始材料的量来确定试剂的用量。对于培养细胞，每次mRNA提取所用的细胞数量上下限分别为108和106。对于纯化的mRNA，则分别用紫外分光光度计测定数量和纯度，用凝胶电泳分析完整性。操作步骤及每步需注意的事项按照PolyATtractSystem1000的protocol进行，并作了些修改，具体如下。1.收集细胞清洁工作用干净纱布擦拭桌面；用酒精棉球擦拭桌面、微量移液器、试管架、止血钳、磁架等；预热试剂将试剂盒中的下列组分取出置于桌面上，暖至室温。GTCExtractionBuffer、BiotinylatedOligo(dT)Probe、Nuclease-FreeWater、SSC（0.5×）洗涤细胞先用无血清培养基1640洗涤细胞，10ml/T75瓶/次，共3次。刮细胞每个培养瓶中分别加入6ml1640，用细胞刮子刮下细胞，注意培养瓶的四个角。镜检判断是否还有残余细胞。将刮下的细胞连同1640转移至50ml离心管。用1640洗涤培养瓶，以回收残留在培养瓶中的细胞，尽量减少损失。1640的用量为：6ml/5瓶。然后将液体与上一步合并。洗涤细胞离心，1,500rpm，10min。去上清，加入预冷的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，并使细胞完全分散。离心，1,500rpm，10mim，去上清，备用。期间，预热DilutionBuffer至70℃。2.裂解细胞在一个新的无RNase和DNase污染的50ml离心管中混和4mlGTCExtractionBuffer和164ulβ-巯基乙醇。Vortex混匀后加到含细胞沉淀的50ml离心管中，高速Vortex至细胞完全裂解。3.探针退火在一个新的无RNase和DNase污染的50ml离心管中分别加入8ml70℃预热的DilutionBuffer和164ulβ-巯基乙醇。Vortex混匀后加到细胞裂解液中，上下颠倒混匀。加入10ulBiotinylatedOligo(dT)Probe，混匀后70℃水浴5min。将裂解液转移至12个1.5mleppendorf管中，室温下离心，12,000rpm，10min（离心前平衡离心机温度至室温。在室温下离心目的是避免溶液中的盐分和去污剂的析出）。将上清分别转移至12个新的1.5mleppendorf管中，室温下离心，12,000rpm，10min。4.洗涤偶联有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs可以安排在步骤3中的离心期间进行。轻摇瓶子，使SA-PMPs完全重悬。转移6mlSA-PMPs至一个新的RNaseFree的50ml离心管中，将离心管置于磁架上，慢慢放平。待磁珠完全聚集到管子一侧时，小心倒掉储存缓冲液。加入6ml0.5×SSC重悬SA-PMPs，磁架捕获后倒掉上清，具体作法同上一步。重复洗涤步骤2次，即洗涤3次，然后加入6ml0.5×SSC重悬SA-PMPs。5.捕获和洗涤磁珠当步骤3完成后，小心转移上清至洗涤过的SA-PMPs中，上下颠倒混匀。注：勿吸沉淀。吸到沉淀会导致整个系统的效能。室温下孵育10min。用磁架捕获SA-PMPs，将上清转移至一个新的RNaseFree的50ml离心管中，冰浴保存至确认有满意的结果为止。用1.8ml（分两次，第一次用1ml，第二次用0.8ml）0.5×SSC重悬SA-PMPs并转移至一个2mlmRNAUserTube