小鼠细胞毒性-T-淋巴细胞相关抗原-4-ELISA试剂盒

北京索莱宝科技有限公司仅供研究，不用于临床诊断小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4ELISA试剂盒产品编号：SEKM0072适用于小鼠血清、血浆或细胞培养上清液等样本北京索莱宝科技有限公司目录背景介绍…………………………………………….............................................…………………………………01检测原理……………………………………………………………………………………………………………01注意事项……………………………………………………………………………………………………………02安全提示……………………………………………………………………………………………………………02试剂盒组成及储存…………………………………………………………………………………………………03自备实验器材………………………………………………………………………………………………………03样品收集及储存……………………………………………………………………………………………………03试剂准备……………………………………………………………………………………………………………04检测步骤……………………………………………………………………………………………………………06结果判断……………………………………………………………………………………………………………06参数表征……………………………………………………………………………………………………………07参考文献……………………………………………………………………………………………………………09常见问题分析及解决办法…………………………………………………………………………………………10北京索莱宝科技有限公司第1页共10页背景介绍：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CytotoxicT-LymphocyteAntigen-4，CTLA-4）和CD28以及它们的配体B7-1和B7-2构成调节T细胞和B细胞应答的主要共刺激途径之一。CTLA-4和CD28是免疫球蛋白（IG）基因超家族成员的结构同源分子，均由单个IgV样细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域组成。CTLA-4和CD28均在细胞表面上表达为经二硫键连接的同型二聚体或单体。编码这两个分子的基因在人染色体2上紧密连锁。CTLA-4最初被鉴定为由细胞毒性T淋巴细胞特异性表达的基因。然而，CTLA-4转录产物已经在Th1和Th2以及CD4+和CD8+中发现T细胞克隆。然而，此后在Th1和Th2以及CD4+和CD8+T细胞克隆中都发现了CTLA-4转录本。然而，95%的CD4+T细胞和50%的CD8+T细胞表面的CD28表达是本构性的，并在T细胞激活时下调，而CTLA-4的表达在T细胞激活后迅速上调，在激活后约24小时达到峰值。尽管CTLA-4和CD28都可以结合相同的配体，但CTLA-4与B7-1和B7-2结合的亲和力比CD28高20-100倍。目前正在研究CTLA-4在T细胞共刺激中的生理作用。重组人或小鼠CTLA-4/Fc嵌合体制剂在R＆DSystems中被证明与B7-1和B7-2具有高亲和力，并竞争性地抑制CD28信号传导。检测原理：本ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗小鼠CTLA-4单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的小鼠CTLA-4会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗小鼠CTLA-4抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠CTLA-4发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的小鼠CTLA-4，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450nm（OD=450nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的小鼠CTLA-4浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中小鼠CTLA-4的浓度。原理图：北京索莱宝科技有限公司第2页共10页注意事项：※※※1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。3.试剂盒使用前请在室温恢复30min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。5.为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。8.为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。北京索莱宝科技有限公司第3页共10页试剂盒组成及储存：试剂盒组成规格（96T）规格（48T）保存条件抗体预包被酶标板8*128*62-8℃标准品2支1支-20℃标准品/样本稀释液（SR1）16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩生物素化抗体120ul(100X)60ul(100X)2-8℃抗体稀释液（SR2）16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩酶结合物（避光）120ul(100X)60ul(100X)2-8℃酶结合物稀释液（SR3）16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩洗涤液（20×）30ml/瓶15ml/瓶2-8℃显色底物（避光）12ml/瓶6ml/瓶2-8℃终止液12ml/瓶6ml/瓶2-8℃封板胶纸4张2张说明书1份1份自备实验器材（不提供，可代购）1．酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）2．高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl3．洗板机或洗瓶4．37℃孵育箱5．双蒸水，去离子水，量筒等6．稀释用聚丙烯试管北京索莱宝科技有限公司第4页共10页样本收集及储存：1.细胞培养上清：将细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000×g离心10min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。2.血清样本：室温血液自然凝固20min后，在4℃条件下1000×g离心10min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。3.血浆样本：将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20min，在4℃条件下1000×g离心10min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。试剂准备：1.试剂回温：首先在实验前30min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。2.配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。3.标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为8000pg/ml)，然后按照以下浓度：4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（8000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。北京索莱宝科技有限公司第5页共10页4.生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。生物素化抗体工作液具体稀释方法如下：板条浓缩生物素化抗体（1:100）：μL检测稀释液（SR2）：μL220198044039606605940880792010100990012120118805.酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。酶结合物工作液具体稀释方法如下：板条浓缩酶结合物（1:100）：μL检测稀释液（SR3）：μL220198044039606605940880792010100990012120118806.洗涤方法：自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注与吸出间隔为30秒，洗板5次。手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止北京索莱宝科技有限公司第6页共10页30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。检测步骤：结果判断：1.用酶标仪450nm波长测定OD值。选择双波长检测，参考波长为630nm。如不能进行双波长检测，请用450nm的OD测定值减去630nm的OD测定值。2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中CTLA-4含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。拍板&洗板5次拍板&洗板4次实验前30min,拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，请洗板3次并甩干加入100l标准品及检测样本至反应孔中,封板后于37℃孵箱孵育90min加入100l生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min加入50l终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）加入100l显色底物至反应孔中，封板后于37℃避光显色15min加入100l酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min拍板&洗板4次北京索莱宝科技有限公司第7页共10页参数表征：1.数据及标准曲线标准品浓度(pg/ml)OD值1OD值2平均值矫正值00.0400.0440.042-62.50.2290.2320.2300.1891250.2640.2680.2660.2242500.3930.3980.3950.3545000.6240.6330.6280.58710001.0131.0271.0200.97920001.6491.6731.6611.61940002.6882.7252.7062.665本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠CTLA-4的样本含量2.灵敏度：北京索莱宝科技有限公司第8页共10页最低可检测小鼠CTLA-4浓度达30pg/ml，20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。3.特异性：不与小鼠CD28/FcChimera,ICOS/FcChimera,PD-1/FcChimera人的CTLA-4/FcChimera等反应4.重复性：板内，板间变异系数10%5.回收率：在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入3个不同浓度水平的小鼠CTLA-4，计算回收率。样本类型平均回收率（%）范围（%）血浆9785－108细胞培养上清10693－1196.线性稀释：分别在选取的4份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓