第五章-目的基因导入受体细胞

第五章重组DNA的获得及目的基因导入受体细胞一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切第一节DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。（一）直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的连接（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾－碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接（3）DNA接头（adapter）连接法①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接②优点：连上后就能用。③缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。④防止自我连接5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’GGCC-p5’BamHIadapterP--P5’HO-GATCCCGG-GGCCCCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15～20bp与模板互补；5’端内切酶识别序列＋保护碱基避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’CCTAGGCGCPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’CCTAGPCR产物-5’3’-GGEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA2.与T载体直接连接第二节受体细胞•又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)，是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。什么是受体细胞(receptorcell)？受体细胞选择的基本原则1.便于重组DNA分子的导入；2.能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；3.便于重组体的筛选；4.遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；5.安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；受体细胞选择的基本原则6.有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。7.在遗传密码的应用上无明显偏倚性；8.具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；9.在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞真核生物细胞•真菌细胞•植物细胞•动物细胞*没有纤维素组成的细胞壁，便于外源DAN进入细胞内*染色体裸露，便于外源DNA重组*基因组简单，便于进行遗传分析*单细胞生物，易于获得一致性受体细胞*培养条件简单，生长快，实验周期短一、原核生物细胞原核生物受体细胞的特点一、原核生物细胞优点：1.大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。2.无核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。3.原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。4.基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。一、原核生物细胞缺点：1.不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。2.缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。至今被用作受体菌的原核生物大肠杆菌枯草杆菌蓝细菌大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。（一）大肠杆菌受体细胞优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制，易于进行工业化批量生产。缺点：通常情况下，细菌RNA聚合酶不识别真核的启动子许多真核基因的蛋白质产物需经过翻译后的加工修饰，而细菌中没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉；大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。（二）枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌优点：1.有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。（二）枯草杆菌受体细胞应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。优点：2.不产生内毒素，无致病性，比较安全。3.具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。4.具有生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ)和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。（三）蓝细菌（蓝藻）蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：1.基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。2.细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。3.营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：4.多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。5.富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。二、真核生物细胞（一）真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。酵母受体细胞*结构简单、遗传背景比较清楚，遗传操作相对比较简单。*具有真核生物蛋白翻译后加工和修饰系统。*不含特异性病毒和毒素，对人类安全。*培养条件简单，可进行大规模发酵，成本低廉。*能将表达产物分泌到细胞外，便于产物的提取和加工。单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统优点：*构建基因组文库*表达外源基因酵母受体细胞应用（二）植物受体细胞*具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合适的条件下可分化成植株*具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得原生质体.优点：（二）植物受体细胞缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。现在用作转基因受体的植物有（三）动物受体细胞转基因羊，鼠，兔，猪，牛等动物受体细胞的特点*体细胞一般无全能性，只能分化到细胞株*生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分化、培养成转基因动物。应用优点：（二）动物受体细胞1.能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。2.真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。3.易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。4.经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。（三）动物受体细胞缺点：组织培养技术要求高，难度较大。常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。第二节重组体导入受体细胞一、重组DNA导入方式（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。（一）转化（transformation）转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。细菌转化的本质转化方式1、热激法（heatshock）2、电转化法（electronporation）3、PEG介导的原生质体转化4、接合转化制备感受态细胞增加受体菌细胞膜的通透性1、热激法①目的感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞制备感受态细胞1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞壁通透性增强，处于感受态；2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。②CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理10ng载体DNA100L感受态细胞冰浴30min42℃1~2min加入1mLLB培养基（Amp-）37℃振荡培养1h10-100L转化液涂Amp＋平板吸附DNA摄入DNA转化的基本操作步骤该法重复性好，操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得106～l08个转化菌落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。优点：2、电转化法原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，形成可逆的瞬间通道，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。电穿法孔转化法须在低温下（0℃~4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响。通过优化这些参数，每gDNA可以得到109-1010转化子。（2）电转化法原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中