植物生理指标测定

实验22过氧化物酶活性的测定过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。一、原理在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料马铃薯块茎。(二)仪器设备722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。(三)试剂(1)0.05mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。(2)0.05mo/L愈创木份溶液。(3)2%H202。(4)20%三氯乙酸。三、实验步骤(一)酶液的制备取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10min,上清被转人25mL,容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。(二)过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系包括:2.9mL.0.05mol/L磷酸缓冲液;1.0ml.2%H2O2；1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。四、结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。过氧化物酶活性=∆𝐴470×𝑉𝑇𝑊×𝑉𝑠×0.01×𝑡[u/（g.min）]式中:∆A470为反应时间内吸光度的变化:W为马铃薯鲜重.g；t为反应时间，mins；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，mL。实验24超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）一、原理超氧物歧化酶(Superxidedismtae,SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基(O2−的酶,它催化下列反应:2O2−+2H+H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2−,O2−可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除O2−，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料水稻或小麦叶片。(二)仪器设备分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。(三)试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。（3）100μmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。（4）20μM核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。三、实验步骤酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5--2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。显色反应取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1各溶液加入量试剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/LMet溶液750μmol/LNBT溶液100μmol/LEDTA-Na2液20μmol/L核黄素酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.050.253.013mmol75μmol10μmol2.0μmol2支对照以缓冲液代替酶液SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：SOD总活性=(Ack−AE)×V0.5×𝑊×𝑉𝑡×𝐴𝑐𝑘式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；Ack为照光管的消光度值；AE为样品管的消光度值；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样鲜重，g。苯酚法测定可溶性糖一、原理植物体内的可溶性糖是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛(分子式见蒽酮法)能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485m波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160min以上。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料新鲜的植物叶片。(二)仪器设备分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。(三)试剂(1)90%苯酚溶液：取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。(2)9%苯酚溶液。取3ml90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml,现配现用。(3)浓硫酸(比重1.84)。(4)1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80C下烘至恒重，精确称取1.000g加少量水溶解,转人100mL容量瓶中，加人0.5m浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线。(5)100ug/蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。三、实验步骤1.标准曲线的制作取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表2-32-3加人溶液和水。表2-32-3苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量试剂管号01、23、45、67、89、10100ug.L-1蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0水/mL2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/ug020406080100然后按顺序向试管内加人1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5—20s加人5mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8mL,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线,求出标准曲线方程。2.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30g,共3份(或干材料)，分别放人3支刻度试管中，加入5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。3.测定吸0.5ml样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，步聚与制作标准曲线相同，按顺序分别加人苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。四、结果计算按下式计算测试样品的糖含量可溶性糖含量=从标准曲线查的糖的含量测定用样品液的体积×提取液体积×稀释倍数106×样品重量×100%实验53脯氨酸含量的测定在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸,因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用同归方程计算）脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂(--)材料待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等)叶片。(二)仪器设备分光光度计，研体，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架,滤纸，剪刀。(三)试剂(1)酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中.搅拌加热(70℃)溶解，贮于冰箱中。(2)3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶剂解后定容至100mL(3)冰醋酸。(4)甲苯。三、实验步骤1.标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒人小烧杯内,用少量蒸馏水溶解，然后倒人250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。(2)系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL及6ug/mL。(3)取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。(4)冷却后各试管准确加人4mL甲苯，探荡30s,前置片刻，使包素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。2.样品的测定(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中，然后向各管分别加人5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常播动),冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取2mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加人2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，在佛水浴中加热30min,溶液即呈红色。(3)冷却后加人4mL甲苯,摇荡30s，静置片刻，取上层液至10mL离心管中，在3000r/min下离心5min。(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。四、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:单位鲜重样品的脯氨酸含量=52×x106×样重×100%实验8-12丙二醛的测定[实验原理]植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是其产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。在