2012.12.18新型光纤传感器及其在生物医学中的应用

基于SERS的新型传感器及其在生物医学中的应用zzc摘要：拉曼光谱测量散射物质的拉曼频移,是物质分子转动和振动能级特性的表征。因此,通过物质的拉曼光谱分析,可以从分子结构上了解物质的构成、特性及其变化规律。本文介绍了表面拉曼增强技术（SERS）的概念及原理特点。之后介绍了SERS在生物医学上的具体应用实例。最后介绍了SERS标记免疫技术的发展趋势。关键词：SERS，传感，生物医学。表面增强拉曼效应拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。1928年C.V.拉曼实验发现，当光穿过透明介质被分子散射的光发生频率变化，这一现象称为拉曼散射，同年稍后在苏联和法国也被观察到。在透明介质的散射光谱中，频率与入射光频率υ0相同的成分称为瑞利散射；频率对称分布在υ0两侧的谱线或谱带υ0±υ1即为拉曼光谱，其中频率较小的成分υ0－υ1又称为斯托克斯线，频率较大的成分υ0+υ1又称为反斯托克斯线。靠近瑞利散射线两侧的谱线称为小拉曼光谱；远离瑞利线的两侧出现的谱线称为大拉曼光谱。瑞利散射线的强度只有入射光强度的10-3，拉曼光谱强度大约只有瑞利线的10-3。小拉曼光谱与分子的转动能级有关，大拉曼光谱与分子振动-转动能级有关。拉曼光谱的理论解释是，入射光子与分子发生非弹性散射，分子吸收频率为υ0的光子，发射υ0－υ1的光子（即吸收的能量大于释放的能量），同时分子从低能态跃迁到高能态（斯托克斯线）；分子吸收频率为υ0的光子，发射υ0+υ1的光子（即释放的能量大于吸收的能量），同时分子从高能态跃迁到低能态（反斯托克斯线）。分子能级的跃迁仅涉及转动能级，发射的是小拉曼光谱；涉及到振动-转动能级，发射的是大拉曼光谱。【1】1974年，Fleishmann等人发现，对光滑银电极表面进行粗糙化处理后，首次获得吸附在银电极表面上单分子层吡啶分子的高质量的拉曼光谱。【2】随后VanDuyne及其合作者通过系统的实验和计算发现吸附在粗糙银表面上的每个吡啶分子的拉曼散射信号与溶液相中的吡啶的拉曼散射信号相比，增强约6个数量级（即一百万倍），指出这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应，被称为SERS效应【3】。经过20多年的研究后，人们知道目前除了电极表面之外，人们还在超高真空系统中蒸镀的金属表面上、金属胶体颗粒表面以及普通金属板经过适当的处理后表面上都进行了SERS实验。一般情况下利用拉曼光谱技术可以非常方便的鉴定物质成分。但是，对于很多的化学物质直接通过拉曼光谱无法检测出信号需要通过拉曼增强技术，提高拉曼信号信噪比，从而检测出待检物质【4】。由于高灵敏度、高分辨率，稳定性好，表面增强拉曼光谱(SERS)广泛应用于表面化学，催化研究，痕量分析，氨基酸、DNA、RNA、蛋白质、核普酸等生物大分子的结构研究与结构分析等。SERS标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的,主要基于类似三明治结构的构建,基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物,通过对标记分子SERS信号的识别进行免疫分析。与其他标记免疫技术相比,它具有其独特的优越性【5】:首先拉曼光谱峰宽度通常比其他光谱如荧光要窄10~100倍;其次拉曼散射受水的影响小;再次SERS信号很少受光致褪色的影响,所以可在一定程度上为获得较好的信号而适当地延长检测时间。另外SERS标记物不会发生自猝灭,可以通过增加标记抗体上标记物的数量来增强SERS信号,提高检测灵敏度。而最具代表性的研究当属Porter【6】于1999年首次将SERS标记分子和羊抗小鼠IgG直接与金溶胶相作用形成标记免疫溶胶,通过相应小鼠抗原与固定在基底上的羊抗小鼠IgG相连,进行SERS免疫检测(见图1)。采用这种标记免疫溶胶方法,金纳米粒子表面产生的电磁场将直接影响相连的标记分子,可产生较强的SERS信号,且不存在距离影响SERS信号的问题。因此无需选用特定的吸收光谱与入射光波长相匹配产生共振效应的分子,拓宽了标记分子的选择范围,这种方法与直接标记法、酶标法相比更体现了SERS其独特的优点。图1以下介绍SERS在生物医学中的一个具体应用Z.Y.Jiang等人做出了以硅为基底的SERS可再现的DNA探测结构（AgNPs@Si）。银纳米粒子在90s内在硅基底上原位生长【7】。图2图2a，b分别是电子显微镜与原子力显微镜下AgNPs@Si的图像。c是40个随机点的SERS光谱。d是在不同数目点下的强度图。图3图3是探测结构图。先将捕手单链DNA连到基底上,捕手单链ＤＮＡ会与目标单链ＤＮＡ结合，而不与其他ＤＮＡ结合。目标ＤＮＡ上连接有ＲｅｐｏｒｔｅｒＤＮＡ（带有Ｒ６Ｇ，一种商用有机染料），因此单链ＤＮＡ和双链ＤＮＡ的ＳＥＲＳ谱线是很不相同的。图4图4a和b表示不同溶液浓度下拉曼光谱强度随溶液浓度下降强度下降。C表示相同溶液浓度下，互补的DNA溶液与不匹配DNA溶液拉曼光谱强度差别很大。SERS标记免疫检测的灵敏度免疫测定是一种很敏感的测定方法。由于亲和力是抗体抗原相互作用的强度特征,所以在建立一种免疫检测法时,抗体抗原的亲和力往往决定了检测限下限,即敏感度的大小【8】。抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度,敏感度可达5-10ug/ml,但在临床检验中,某些待测物在标本中的含量远低于这一水平,因此要寻找增加敏感度的方法。标记免疫测定则是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记,通过测定标记物来提高敏感度。Ekins提出了一系列关于标记免疫分析灵敏度的富有指导性的观点【9-10】,认为影响免疫分析灵敏度的主要因素有:(1)抗体一抗原间免疫反应的亲和性,这是影响免疫分析灵敏度的最根本因素。采用高亲和性抗体是实现高灵敏免疫分析的前提;(2)标记物的比活度(可检测性),采用高比活度的标记分子有利于提高免疫分析的信噪比;(3)实验操作的精确性,规范的实验操作或自动化程度的提高有利于减少实验误差;(4)结合标记物与游离标记物分离的完全程度;(5)抗体一抗原免疫反应的特异性。现在较普遍的标记免疫检测一般有放射免疫检测、酶联免疫检测、以化学发光为代表的光生物学标记【11】等免疫检测技术。这些传统意义上的检测方法的检出限范围一般为0.05~0.5ng/mL。与此同时,免疫聚合酶链式反应(PCR)技术和SPR生物免疫传感器更是在最近十多年内得到了迅猛的发展。前者是以PCR代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率,能检出浓度低至2pg/mL的抗原物质。后者则是通过检测分子间表面等离子激元共振(SPR),对待测样品进行生物特异性相互作用分析,通过制备良好的免疫敏感膜可检出每mm2小于10ng的样品。SERS作为一种免疫检测的新方法在近年来得到了很大的发展,它在标记免疫研究领域无疑也是一个理想的工具,特别体现在它的谱带窄,灵敏度高的特点上。通过采用具有表面增强效应的固相基底或标记颗粒进行SERS免疫检测充分发挥了SERS特殊的表面增强效应。同时采用较强SERS效应的标记分子,增加标记分子吸附量有利于提高免疫分析的灵敏度。目前提高SERS标记免疫检测灵敏度的方法主要有:(1)多官能团标记Porter等采用的双官能团标记分子代替单官能团标记分子是提高检测灵敏度的方法之一【12】,图5为其标记示意图。双官能团标记分子一端通过巯基与金纳米粒子相连,另一端与抗体相连,这种方法大大增加了金纳米粒子表面吸附标记分子的数量,提高了检测的灵敏度,其待测抗原的检出限达到了1pg/mL。图5(2)金银染色技术Mirkin【13】等将SERS标记免疫与医学上的银染色技术相结合进行免疫识别,利用银的强SERS效应,在标记免疫金纳米粒子与固相抗体所捕获的抗原发生免疫识别后进行银染色以获得较好的SERS活性。Xu等通过将免疫金溶胶进行银染色【14】,以对巯基苯甲酸(4-MBA)为标记分子对乙肝表面抗原进行了SERS免疫识别分析,并且获得了1~40ug/mL的检测限范围(见图6)。其实验中存在较强的背景干扰,他们认为这是由于随着抗原浓度的递增,连接的免疫金溶胶也会随之增加,从而免疫金溶胶上沉积的染色银聚集体增加,导致银背景信号的增强,银染色法虽然能使检测灵敏度得以提高,但存在的另一个问题就是银染色过程可能会导致生物分子中毒。图6(3)金银核壳纳米标记金银核壳纳米标记是在金银染色基础上发展起来的新兴免疫标记技术。CuiY等人【15】采用Ag核Au壳复合纳米粒子,以苯硫酚(TP)为标记分子,发现在其表面的SERS增强随Au摩尔比例的增加呈现先增强后减弱的趋势,其最大增强为相应银纳米粒子的10倍。而这较强的SERS增强效应是来自于表面孔洞所产生的电磁场增强,将这种特殊的核壳纳米粒子应用于SERS标记免疫检测,既可以获得较高的检测灵敏度,同时金壳的存在又不会使检测的蛋白质分子失活(见图7)。图7Ji,Xu【16】等用Au核Ag壳复合纳米粒子代替银染色法以避免抗体失活这一问题,以4-MBA为标记进行SERS免疫检测,他们发现在银壳为3nm时,获得了最大的SERS增强效应。但Au核Ag壳复合纳米粒子的薄层银壳是否对抗体抗原的活性有较大影响还有待考证。展望目前,SERS标记免疫检测的发展方向主要集中在以下几个方面:(1)提高SERS免疫分析的灵敏度及消除非特异性吸附带来的假阳性干扰,成为近年来令人关注的热点。各种高度灵敏的标记示踪体系为SERS标记免疫分析的集成化提供了前提。痕量的生物检测,高示踪性的标记分子是研究的关键。同时,SERS标记免疫检测基底的制备与修饰(包括生物分子在基底上的组装包被技术)还需要进一步成熟。(2)实际应用中为降低分析成本,检测基底必须有良好的再生性;须采用真正可行的分离方式。在不影响特异吸附的同时,这就对分离的彻底性、方法的多样性提出了更高的要求。另外,在重复使用的基础上,还要考虑其分离选择性的提高,以便在实际应用中去除所不需要的待测物,进行高度选择的免疫检测。(3)随着人们对自身健康的日益关心,适合于商品化、应用化的免疫分析将有更广阔的市场。在今后的免疫检测中,固相基底的样品处理、标记,生物分子的纯化等都需要得到有效的改进,从而使SERS标记免疫检测可以在芯片上实现一体化操作。作为表面化学发展起来的SERS技术为生物免疫化学提供了新的手段,目前已有端倪说明这两种技术的联用可以发挥其特殊的作用,只需在设计上再加以改进,这些目标是不难达到的。Reference【1】KneiPP.J,Surface-enhancedRamanScattering:anewopticalprobeinmolecularbiophysicsandbiomedicine.TheoreticalChemistryAccounts2010,125(3-6),319-327.【2】Fleisellnlann.M，Hendra，P.J.McQuillan，RamanSPeetraofPyridineAdsorbedataSilverEleetrode.Chen，ChemicalPhysicsLetters，1974,26,163-166【3】Jeanmaire.D.L,VanDuyne.R.P,SurfaceRamanElectrochemistryPart1.Heterocyclic,AromaticandAliphaticAminesAdsorbedontheAnodizedSilverElectrode.JournalofElectroanalyticalChemistry,1977,84,1-20【4】S.M.NieandS.R.Emory,Science275,1102(1997)【5】NathanielLR,MirkinCA.Chem.Rev.,2005,105:1547.【6】NiJ,LipertRJ,PorterMD,etal.Anal.Chem.,1999,71:4903.【7】Z.Y.Jiang,X.X.Jiang,