实验三-琼脂糖凝胶电泳

实验二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA片段。凝胶中DNA的位置可以用低浓度的荧光插入染料染色直接观察。1、学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法2、检测质粒DNA的纯度、浓度和分子量一、实验目的琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。（GoldviewI的原理可能类似）质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋线性开环)。二、实验原理不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围1、0.8%：500bp-15kb2、1.0%：250bp-12kb3、1.2%：150bp-6kb4、1.5%：80bp-4kb注意：高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降！上次实验提取的质粒pSK（3kb）和MP3（6kb）三、实验材料关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时所处的位置指示质粒的大小。该质粒载体用的是pUC的复制子，拷贝数能达到500-700个。四、仪器设备五、实验用具微波炉电泳仪微型电泳槽紫外透射检测仪凝胶成像仪移液器吸管头若干加样板量筒100ml1三角瓶500ml1六、试剂琼脂糖5TBE电泳缓冲液10载样缓冲液（loadingbuffer）GoldViewI型核酸染色剂（10000）DNA分子量标准（DNAmarker）：MarkerIII10载样缓冲液：10mMEDTA，0.25%溴酚蓝，50%蔗糖七、实验步骤（一）制胶（1%agarosegel）（二）点样（三）电泳（四）观察1、称取1g琼脂糖加入盛有100ml0.5TBE电泳缓冲液的250ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60℃后，加入10l的GoldviewI，并摇匀。2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。（一）制胶（二）点样用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2l于点样板小孔中，再加入8lTE及1l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5lMarkerⅢ作为分子量标准。打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。（三）电泳（四）观察将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。1、用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。2、煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。3、倒胶注意厚度(4-6mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10分钟，以加速胶的凝固。4、加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。5、一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液（正极）洗几次即可再点下一个样品。6、凝胶中含有GoldViewI，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。注意事项常用电泳缓冲液配方TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存；TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀；分离大片段最好用TAE，小片段用TBE；TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。TAE和TBE的主要区别有的10×loadingbuffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有电泳指示剂和沉淀样品的作用。常用6×凝胶加样缓冲液配方Loadingbuffer的功能：第一、指示剂溴酚蓝和二甲苯青起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二、甘油或者蔗糖可以加大样品密度，使样品密度大于TAE或TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。前沿指示剂溴酚蓝溶液在酸性条件下为黄色，碱性条件下为蓝色。因为提取的核酸一般都是溶解在碱性的TE缓冲液里，所以与loadingbuffer混合后变为蓝色。Marker跟DNA用一样的上样缓冲液，跑出来的结果才好，如果marker预先混合了上样缓冲液，DNA样品的上样缓冲液还是尽可能找跟marker预混的上样缓冲液一致。EDTA是螯合剂，可以螯合钙和镁等金属离子，能够使金属依赖型核酸酶失活，从而防止DNA和RNA降解。PCR产物电泳一般用6×loadingbuffer就可以；酶切产物电泳和回收一般用10×loadingbuffer以减少上样体积。在紫外照射透视下，与双链DNA结合的吖啶橙呈现绿色荧光，而结合RNA或单链DNA的吖啶橙则呈现红色荧光。不同波长的紫外光短波紫外光：254nm中波紫外光：302nm长波紫外光：365nm1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？第一次电泳第二次电泳第一次电泳第二次电泳2011年结果GoldViewIGoldViewIIPlasmidDNALine1,λ-DNAEcoRI/HindⅢMarker;Line2,PUC18(2686bp);Line3,EcoRIdigestionofPUC18;Line4,Cambia3301(11220bp);Line5,EcoRIdigestionofCambia3301质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒连在了一起）。同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱由于DNAMarker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！质粒酶切电泳结果的分析注意：如何判断单酶切是否完全？如何判断双酶切是否完全？注意：同样的marker点在不同的胶孔中，电泳迁移率有差异。因为电泳时有边缘效应，边上的跑得快；跑胶时间长了会发热，整快胶受热不均时也会出现这种现象。但因为抽提质粒时各人的操作差异,造成CCC/OC/L等多种构型，条带多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三条：超螺旋、开环和复制中间体。如果RNaseA添加过少或者质量不高，会导致RNA降解不完全，会有一条远离点样孔跑的最快的残余RNA条带；根据RNA降解程度不同，条带亮度会有很大差异。提取过程中加溶液震荡剧烈会导致基因组片段断裂成很小的片段，因此质粒中含有基因组的短片段会导致一些电泳条带的出现。还有电泳时间的长短造成各条带的移动距离也不一，一般较难判断是对是错。电泳跑的时间较短，尽管能分出大小，但习惯上跑开点对分辨差别不大的条带有好处，短胶容易出现误判。碱裂解法抽提质粒电泳会出现几条带？1、对于反复使用的琼脂糖凝胶，DNA的电泳效果有所降低，如要获得最佳的电泳图片，请使用新配置的凝胶和电泳缓冲液。2、胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。3、加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响。4、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复熔化会降低分辨效率，建议不要超过3次。关于琼脂糖凝胶使用的注意事项思考题1、DNA在碱性缓冲液中带什么电荷？电泳时向哪一极移动？2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？分辨率与凝胶浓度的关系？3、DNA荧光染料的发光原理？4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？5、loadingbuffer成分是什么？各成分有何作用？