6-密度梯度离心法分离叶绿体

细胞生物学实验2014-2015（1）报告成绩实时记录成绩实验六密度梯度离心法分离叶绿体学生姓名学号班级座位号：同组同学日期：年月日备注：【Introduction】（1）组织细胞破碎的方法和原理：细胞破碎是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物释放出来的技术。破碎方式有机械法和非机械法。机械法是使用物理的方法破坏细胞膜或细胞壁结构，处理量大，破碎效率高，速度快，但是容易使不稳定产品变性失活。包括了研磨法、珠磨破碎法、超声波法、高压匀浆法、X-Press法等。非机械法则使用了化学的方法，较温和，有一定选择性，但效率较低。包括了渗透压法、酶解法、增溶法、脂溶法、碱处理法等。（2）离心机使用中的注意事项：离心技术里的颗粒沉降速度受到重力、固液相对密度的差别、颗粒的大小形状、沉降介质的粘滞力和离心场的大小等因素影响，使用时必须事先在天平上精确平衡离心管和其内容物。离心过程中不得随意离开，液体不得装得过多防止甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。若要在低温下离心，转头在使用前应放置在冰箱预冷。另外，每个转头各有其最高允许转速和使用期限，不得过速使用。（3）简述密度梯度离心的原理：密度梯度离心法，是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。最常用的介质为蔗糖等。密度梯度离心法精确度比差速离心法大，但是操作起来较繁琐，需要一定技巧。【Materials&methods】实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；1.5和5ml离心管；低温高速离心机（角转子）。实验材料：菠菜叶。试剂：0.35MNaCl，蔗糖溶液（0.5M/150g/L、1.5M/500g/L）。（1）组织破碎匀浆：洗净菠菜叶→擦去水分，去茎→每班称取6g→4℃预冷的试剂瓶中吸取20ml0.35MNaCl→加到冰浴的搅拌机→叶片剪碎至搅拌机容器中→打开电源，高速切碎叶片20S，冰浴冷却1m→再反复操作2次，共搅碎60s→过滤至冰浴的小烧杯中。（2）离心分离：吸取匀浆液2mL至2mL离心管→4℃，500rpm，离心10min→制备密度梯度管→吸取离心后溶液400uL缓缓加入密度梯度离心管→4℃，8000rpm，离心20min。（3）显微镜观察：取出离心管→轻轻吸出中间绿色薄带→加入新的1.5mL离心管中→取20uL至干净载玻片→盖上盖玻片→显微镜40倍镜或油镜下观察。细胞生物学实验2014-2015（1）【Results】滴片后在显微镜40倍镜下可以观察到：有许多绿色、橄榄形的细胞器，即为叶绿体，数量较多，密度较大。【Discussion】1.讨论实验中进行细胞器分离纯化的注意事项。答：为了保持叶绿体的活性，本实验需要一直维持在冰浴或4℃环境中。使用离心机的时候，由于离心时产生很大的离心力，必须事先在天平上精确平衡离心管和其内容物。吸取上清液时应将离心管略微倾斜，将枪头轻靠在管壁内且从溶液上方开始缓慢吸出液体，不要使液体浑浊；密度梯度离心加入上层低密度液体时，也应将枪头轻靠上侧液面管壁上缓慢加入液体，加完后上下层液体应有明显界限。2.若镜检实验结果不理想，请分析原因？答：如果叶绿体偏少，可能是温度没有控制在4摄氏度左右，使叶绿体失活；或者离心后晃动了又将溶液混合起来了；或者密度梯度没有做好，分层不明显。如果叶绿体偏多，可以做适当的稀释。【Questions】1.若分离纯化线粒体和细胞核，应如何操作？答：动物的细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎。如果要分离纯化线粒体和细胞核，要将剪碎的组织包括液体移入匀浆器，收集滤液并离心、密度梯度离心，然后用分别用健那绿染液和改良苯酚品红染液染色，这样才能观察到蓝绿色的线粒体和紫红色的细胞核。2．若用吖啶橙染色叶绿体分离液，会出现什么现象，解释为什么细胞核的吖啶橙染色与叶绿体的吖啶橙染色不同。答：用吖啶橙染色后，叶绿体发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光。吖啶橙是一种荧光色素，与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。[1]【References】1李沂轩,纪岩文.吖啶橙染色方法检查线索细胞.中国皮肤性病学杂志.2005年第11期.细胞生物学实验2014-2015（1）实验六密度梯度离心法分离叶绿体（错误）学生姓名学号班级座位号：同组同学日期：年月日备注：【Real-timeRecord】流程具体步骤备注1破碎匀浆(1)每组称取新鲜绿叶1g→干净小烧杯→移液枪吸取4ml0.25M蔗糖缓冲液→将组织剪成约1mm3小块。(2)将剪碎的组织包括液体移入匀浆器的外管中→再将内管插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉动，匀浆7-10分钟→六层纱布过滤回洗净的原烧杯中。(3)每组取1个5ml离心管，加入匀浆液2ml。2离心分离2ml匀浆→离心(2000rpm,10m)→上清U1转入烧杯(1)沉淀D1→悬浮(加2ml0.25M蔗糖)→离心(3000rpm,10m)①上清U2转入烧杯②沉淀D2→悬浮(加1ml0.34M蔗糖)→制梯度液(0.8ml0.88M蔗糖)→离心(4000rpm,15m)→沉淀D3(2)上清U1和U2混合物→分装2x1.5ml→离心(5000rpm,10m)①沉淀D4②上清2x1.2ml→离心(10000rpm,10m)→沉淀D5→悬浮(加0.5ml0.25M蔗糖)6染色镜检(1)线粒体染色：10μl沉淀D5悬浮液涂片→10μl健那绿染液混合→盖玻片→观察线粒体（高倍镜/油镜）。线粒体易失活，注意快速低温操作，并及时观察。经染色后呈蓝绿色。(2)细胞核染色：黄枪头蘸取沉淀D3涂片→10μl改良苯酚品红染液→5~10分钟后加盖玻片→观察细胞核。经染色后呈紫红色。