免疫学技术

免疫学实验技术免疫学技术--抗原抗体反应可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测影响因素:电解质、温度酸碱度免疫标记技术:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应特点:高度灵敏、特异、快速,定性、定量、定位分类:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定Ⅰ.ELISAⅡ.免疫组化Ⅲ.荧光抗体标记Ⅳ.荧光原位杂交（FISH）Ⅴ.分光光度法Ⅰ.酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应.酶结合物具有双功能:高度特异的免疫反应、生物催化放大作用基本方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法、生物素-亲和素系统间接法a.将已知可溶性抗原吸附于载体b.温育后清洗c.加入可能含特异性抗体的待检液d.温育后清洗e.加入酶标记的二抗f.温育后清洗g.加入酶作用底物h.测定反应颜色深浅a.将已知抗体吸附于载体上b.温育后清洗c.加入可能含特异性抗原的待检液d.温育后清洗e.加入酶标记特异性抗体f.温育后清洗g.加入酶作用底物h.测定颜色反应深浅双抗体夹心法a、将已知抗体吸附于载体上b、温育后清洗c、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液d、温育后清洗e、加入酶作用底物f、测定颜色反应深浅竞争法生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem）生物素:一种维生素H,经活化后可与抗体、抗原、酶以多配一方式共价结合,且不影响它们的活性亲和素:从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,可与酶偶合,以一配多的方式对生物素有很强的亲和力BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法/BA法/ABC法生物素-亲和素系统BAS法与常规酶法ELISA操作注意事项1.待检样品不应反复冻融2.加样前充分混匀样品3.洗板:保证洗涤次数,确保冲洗干净4.加完终止液在要求时间内上机检测,反应温度最好在37℃ELISA检测标本1.血清或血浆2.尿液3.脑脊液、关节液等体液4.细胞培养上清等ELISA试验用耗材、试剂及仪器耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物溶液、终止液仪器:酶标仪ELISA结果分析1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线性回归方程进行统计分析,可求得待测样品的定量值2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶标仪上进行设置,机器自动计算打印出标准曲线及各待测样品的定量结果Ⅱ.免疫组织化学技术免疫组化是组织化学的一种,是利用已知的抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反应使结合在特异性抗体上显示剂(酶、金属离子、同位素等)显示一定的颜色,在显微镜下观察颜色的变化,在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质1.阳性标记色度特征免疫组化细胞阳性程度与抗原含量、分布密度、标记方法有关.一般抗原含量越多、密度越高、标记方法越敏感,阳性显色则越强.淡黄色,弱阳性;黄色,阳性;棕黑色,强阳性.结果判断中,后两者有意义,前者除标本处理和方法学因素外,与细胞轻度异常表达及某些细胞摄取了周围组织抗原有关2.阳性标记细胞学特征免疫组化阳性细胞反映抗原在细胞中的定位和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提,阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：⑴胞膜型阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）⑵胞核型阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀分布位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布.多见增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等⑶胞浆型阳性颗粒主要分布于细胞浆.大部分抗原均属此型,如细胞角蛋白、波形蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原（PSA）等.抗原在胞浆内分布通常为弥漫性或局限性.弥漫性是阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆,局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧⑷微绒毛型抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛,胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达.此形最常见于各种腺癌,如甲状腺、乳腺、胃肠、胆道、卵巢浆液性腺癌等.特点是阳性颗粒靠近腔面,基底部可呈阴性反应.在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等,甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现⑸复合型常规免疫组化标记中,同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆,很少发现胞膜和胞核同时表达.应注意组织标本固定不及时造成抗原移位3.阳性标记组织学特征根据免疫组化阳性细胞的组织学特点,免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列:局灶型弥漫型片块型网状型腺管型腔缘型菊团型4.阳性标记强度特征细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、阳性和强阳性;也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为:弱阳性,阳性细胞≤25%;阳性,阳性细胞25%~50%;强阳性,阳性细胞50%5.非特异着色特征下面情况可干扰免疫组化结果的观察和判断：（1）抗体交叉反应:是由于该抗原决定簇同时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮.S-100蛋白则更为严重,可表达于多种组织细胞.因此应全面了解和认识该抗体的功能和标记范围（2）肿瘤细胞异常表达:可选用多种标记证实或排除,鉴别其真正组织来源或向某一组织细胞分化（3）肿瘤细胞吞噬组织抗原:某些恶性肿瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分,虽然后者也存在某些抗原,但不属于瘤细胞固有成分,胞浆内抗原定位较模糊,因此应该区别（4）非特异性染色:是指抗原无明确定位,细胞与间质均为黄色,相互累及一片,色度无深浅之分.常原因见为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等.免疫组化特异性染色定位非常重要,如果缺乏细胞间的不均一性染色即使阳性染色,常提示为非特异性染色.组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊断依据免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识免疫组化结果判断原则⑴.必须设染色对照每批染色都要以特异性阳性对照和阴性对照为基础.没有阳性对照就不能做出真正阴性结果的判断;没有阴性对照,也就不能做出真正阳性结果的判断.没有对照的免疫组化结果是不可信的⑵抗原表达必须在特定部位阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位,如LCA在细胞膜上、S-100蛋白在胞浆和胞核内,不在抗原所在部位的阳性表达不能视为阳性⑶阴性结果不能视为抗原不表达即阴性结果不能认为具有否定意义;阳性表达有强弱、多少之分,只有少数细胞阳性（在抗原所在部位）也要视为阳性表达引起假阴性和假阳性结果的原因假阴性结果的原因主要是：（1）抗体已失活或浓度不当（2）组织自溶(抗原扩散)导致抗原消失,特别长期固定标本,应多用新鲜标本（3）操作步骤不当,如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高（4）组织或细胞中抗原的含量很低假阳性结果的主要原因（1）所用的抗体有交叉反应,特异性差，特别应用多克隆抗体时更易出现（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色免疫组化操作经验和体会操作注意问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可,要注意防止脱片2.充分消除内源性过氧化酶和非特异性染色3.PBS洗涤要充分4.要设阴性和阳性对照5.显色注意底物要适量、时间要严格控制6.消除内源性生物素活性:先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min7.ABC复合物应在临用前30min配置8.ABC试剂保存温度为4℃9.抗体保存：-20℃分装冻存,或于4℃常规使用,切忌反复冻融免疫组化常遇问题1.均匀的背景染色:酶-底物反应时间过长、孵育切片干燥、一抗或二抗稀释度不够、切片洗涤不充分、封闭用的正常血清不对2.部分区域背景着色:切片部分区域干燥、显色反应物在封片介质中可溶、造成弥散3.部分区域不着色:脱蜡不完全、切片部分区域干燥4.各种孵育结果所有抗体均不着色:H2O2终浓度不够或存放过久、稀释液中有错误的正常血清、显色反应物溶于脱水的酒精及二甲苯或封片液5.某些抗体不着色:需要消化而没有消化、封闭内源酶时使抗体活性下降、切片在裱片或干燥时过热、抗体过度稀释、一抗浓度小于二抗、抗体过期或频繁冻融6.内源性酶活性:H2O2-甲醇封闭不当7.脱片:切片无粘附试剂、切片不干净、组织在贴片前已经充分固定8.核轮廓模糊:切片已干燥、苏木素染液欠佳9.非特异性染色:底物未过滤、抗体未离心10.阳性反应太弱:抗体或其它试剂活性下降、显色反应时间过短、抗体的稀释度或孵育时间不够、加抗体时切片上缓冲液过多11.切片镜下模糊或黑点沉着:脱水不彻底、进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯混合液、温箱干燥替代脱水过程Ⅲ免疫荧光标记技术荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后,即刻引起发光,停止能量供给,发光亦瞬即停止.荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光,并能作为染料使用的有机化合物,亦称荧光色素.目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RB200)及四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)FITC:最大吸收光谱490-495nm,最大发射光谱520-530nm，黄绿色RB200:最大吸收光谱570-575nm，最大发射光谱595-600nm，橙红色TMRITC:最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，橙红色基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合,以荧光素作为标记物,与已知的抗体(或抗原)结合、不影响其免疫学特性.将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原.在荧光显微镜下,可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位荧光抗体染色方法直接法:这是荧光抗体技术最简单和基本的方法.滴加荧光抗体于待检标本片上,经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察.标本中如有相应抗原存在,即与荧光抗体特异结合,在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物.此法的优点是简单、特异.但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体,且敏感性低于间接法间接法:首先将待测抗体加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间冲洗;滴加标记抗抗体.如第一步中抗原抗体发生结合,加入的标记抗抗体和已固定在抗原上的抗体分子结合,形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物并显示荧光.此法优点是敏感性高于直接法,缺点容易产生非特异性荧光免疫荧光实验的注意事项1.反应过程一定要避光,操作过程尽量避光2.操作过程结束,尽快荧光显微镜下看结果3.注意镜下结合荧光与非结合荧光的区别4.每次实验应该提前激发荧光显微镜光源5.使用荧光显微镜时间1-2h为宜Ⅳ荧光原位杂交（FISH）技术荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是建立在核酸分子杂交和放射性原位杂交基础上的非放射性原位杂交技术，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交它是基于DNA探针序列与标本细胞中互补序列的特异碱基配对的原理,DNA探针经引入报道分子（如生物素或地高辛）的化学修饰后，可利用与特异报道分子结合物（如亲和素或直接抗报道分子的抗体）偶联的荧光染料加以检测。FISH技术可用于染色体的DNA检测、基因定位、转基因检测、染色体异常观测及疾病的诊断等众多领域染色体荧光原位杂交始于细胞遗传学和DNA技术的结合,基础为Southernblot原理,以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交,互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,通过荧光标记在通过荧光显微镜观察杂交信号荧光原位杂交优点1.快速灵敏、特异性好,可同时分析分裂期和间期的多个细胞