SNT 2521-2010 单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２１—２０１０单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法犛犲狉狅狋狔狆犻狀犵狅犳犔犻狊狋犲狉犻犪犿狅狀狅犮狔狋狅犵犲狀犲狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法ＳＮ／Ｔ２５２１—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数９千字２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８５７　定价１４．００元食品伙伴网书书书前　　言　　本标准的附录Ａ为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曾静、魏海燕、张西萌、王金花、陈广全、张惠媛、饶红、付溥博、畅晓辉、张昕、汪琦、马旭。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２１—２０１０食品伙伴网单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法１　范围本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的血清分型方法。本标准适用于对单核细胞增生李斯特氏菌进行血清分型，单核细胞增生李斯特氏菌的溯源可参照本方法。２　规范性引用文件　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。　　ＧＢ／Ｔ４７８９．３０　食品卫生微生物学检验　单核细胞增生李斯特氏菌检验ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　设备和材料３．１　台式离心机：１６００犵。３．２　冰箱：４℃～６℃。３．３　ＭｃＦａｒｌａｎｄ浊度计。３．４　加热器。３．５　接种针。３．６　试管：６ｍｍ×５０ｍｍ。３．７　试管架：适用于６ｍｍ×５０ｍｍ试管。３．８　移液器：适用于２５μＬ，５０μＬ，１００μＬ。３．９　恒温水浴：４８℃。３．１０　无菌载玻片。３．１１　生物安全柜。４　培养基和试剂４．１　ＳＩＭ动力琼脂：见第Ａ．１章。４．２　胰蛋白磷酸盐肉汤（ＴＰＢ）：见第Ａ．２章。４．３　３７％甲醛溶液。４．４　０．８５％灭菌生理盐水：见第Ａ．３章。４．５　含０．５％甲醛生理盐水：见第Ａ．４章。４．６　Ｏ抗血清。４．７　Ｈ抗血清。５　方法提要待测菌株应是经鉴定确证为单核细胞增生李斯特氏菌的纯培养物，单核细胞增生李斯特氏菌的抗血清与李斯特属其他种之间存在交叉反应现象，所以错误鉴定的或不纯的培养物，在进行血清型鉴定时会得出错误的结果；Ｈ抗原，又称鞭毛抗原，Ｈ抗原位于细菌鞭毛上，在鉴定Ｈ抗原时应使用有运动性１犛犖／犜２５２１—２０１０食品伙伴网的菌株；应先鉴定Ｈ抗原，后鉴定Ｏ抗原。单核细胞增生李斯特氏菌Ｏ抗原和Ｈ抗原的关系见表１。表１　单核细胞增生李斯特氏菌血清型抗原结构血清型Ｏ抗原Ｈ抗原１／２ａⅠ，ⅡＡＢ１／２ｂⅠ，ⅡＡＢＣ１／２ｃⅠ，ⅡＢＤ３ａⅡ，ⅣＡＢ３ｂⅡ，ⅣＡＢＣ３ｃⅡ，ⅣＢＤ４ａ（Ⅴ），Ⅶ，ⅨＡＢＣ４ａｂⅤ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅸ，ⅩＡＢＣ４ｂⅤ，ⅥＡＢＣ４ｃⅤ，ⅦＡＢＣ４ｄ（Ⅴ），Ⅵ，ⅧＡＢＣ４ｅⅤ，Ⅵ，（Ⅷ），（Ⅸ）ＡＢＣ７Ⅻ，ⅩⅢＡＢＣ６　检验流程单核细胞增生李斯特氏菌血清分型流程见图１。图１　单核细胞增生李斯特氏菌血清分型程序图２犛犖／犜２５２１—２０１０食品伙伴网７　单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法７．１　犎抗原鉴定７．１．１　将活化的待测菌株用接种针垂直穿刺接种于ＳＩＭ动力培养基，２５℃，培养２４ｈ～４８ｈ。典型的单核细胞增生李斯特氏菌在ＥＢ半固体培养基上呈伞状生长。７．１．２　挑取生长在ＳＩＭ动力培养基伞状菌苔边缘，接种于ＴＰＢ液体培养基，２５℃，培养１８ｈ～２４ｈ。７．１．３　在ＴＰＢ培养液中加入３７％甲醛溶液，使甲醛的终浓度为０．５％（在８ｍＬ的培养液中加入０．０４ｍＬ的３７％甲醛溶液），２５℃处理菌体细胞４ｈ。７．１．４　离心收集菌体，１６００犵，离心３０ｍｉｎ。７．１．５　重悬菌体细胞于含０．５％甲醛生理盐水中，调整菌体细胞浓度≥ＭｃＦａｒｌａｎｄＮｏ．３，该菌悬液为标准菌悬液；也可以用经甲醛处理的单核细胞增生李斯特氏菌ＴＰＢ菌悬液进行Ｈ抗原凝集反应，其凝集反应结果应与用０．５％甲醛生理盐水洗涤的标准菌悬液相同。７．１．６　在６ｍｍ×５０ｍｍ试管中分别加入１００μＬ经稀释的Ｈ抗血清，Ａ，Ｃ和Ｄ，与等体积经甲醛处理的菌悬液充分混匀，同时用０．８５％灭菌生理盐水代替抗血清作为阴性对照，４８℃水浴保温；在４８℃水浴保温１ｈ之后，用肉眼观察是否有凝集反应发生。凝集反应表现为：形成沉淀，上清液清澈，有凝集反应发生，为阳性反应，可判定相应Ｈ抗原；如无凝集反应发生，则可判断为阴性反应。７．２　犗抗原鉴定７．２．１　将活化的待测菌株接种于ＴＰＢ液体培养基，３５℃培养１８ｈ～２４ｈ，１６００犵，离心３０ｍｉｎ收集菌体，如果用玻片法进行凝集反应，用ＴＰＢ培养基洗涤菌体细胞一次；如果用试管法进行凝集反应，用含０．５％甲醛生理盐水洗涤菌体细胞一次。７．２．２　玻片法７．２．２．１　用含０．５％甲醛生理盐水重悬菌体细胞，制成高浓度的菌悬液（菌悬液的浊度等于或高于ＭｃＦａｒｌａｎｄＮｏ．３），置２５μＬＯ抗血清于灭菌玻片上，与等体积的菌体抗原充分混合，同时用２５μＬ，０．８５％灭菌生理盐水与等体积的菌体抗原混合作为阴性对照。７．２．２．２　用手握住载玻片的两边，在黑色背景衬托下，接近灯光进行观察。如果凝聚反应不典型，用试管法进行凝集反应。７．２．３　试管法７．２．３．１　试管法鉴定Ｏ抗原的方法与鉴定Ｈ抗原的方法基本相同。所不同的是将等体积混合的Ｏ抗血清和菌体抗原，４８℃保温２ｈ后，在４℃冰箱过夜，观察凝集反应结果；或是在４８℃水浴保温过夜，观察凝集反应结果。８　血清型结果判定根据Ｈ抗原和Ｏ抗原凝集反应结果从表１查到相应的血清型。９　安全措施为了保护试验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置。并按ＧＢ１９４８９中有关规定执行。犛犖／犜２５２１—２０１０食品伙伴网书书书犛犖／犜２５２１—２０１０附　录　犃（规范性附录）培养基和溶液配制犃．１　犛犐犕动力琼脂犃．１．１　成分胰胨２０．０ｇ多价胨６．０ｇ硫酸铁胺０．２ｇ硫代硫酸钠０．２ｇ琼脂３．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２　制法将上述各成分加热混匀，调ｐＨ７．２，分装小试管，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．２　胰蛋白磷酸盐肉汤（ＴｒｙｐｔｏｓｅＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｒｏｔｈＴＰＢ）犃．２．１　成分胰大豆琼脂４０．０ｇ酵母抽提物６．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２．２　制法用孔径为２０μｍ细菌过滤器过滤除菌。犃．３　０．８５％生理盐水将０．８５ｇ氯化钠溶解于１００ｍＬ蒸馏水中，分装，高压灭菌１２１℃，１５ｍｉｎ。犃．４　含０．５％甲醛的生理盐水将０．８５ｇ氯化钠溶解于１００ｍＬ蒸馏水中，加０．５ｍＬ的甲醛，分装，高压灭菌１２１℃，１５ｍｉｎ。０１０２—１２５２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２０８５７定价：　　１４．００元食品伙伴网