SNT 2124-2008 大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２４—２００８大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犌狔狉狅犱犪犮狋狔犾狅狊犻狊狅犳犃狋犾犪狀狋犻犮狊犪犾犿狅狀（犌狔狉狅犱犪犮狋狔犾狌狊狊犪犾犪狉犻狊）２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准修改采用了国际兽疫局（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１４章。本标准与《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１４章相比，主要差异如下：———对聚合酶链式反应和扩增产物的电泳过程进行了优化；———重新编排了格式。本标准的附录Ｂ是规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ、附录Ｅ、附录Ｆ、附录Ｇ是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘荭、邱杨、江育林、史秀杰、何俊强、高隆英、叶奕优。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１２４—２００８大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范１　范围本标准规定了大西洋鲑鱼三代虫显微镜检和聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。本标准适用于大西洋鲑鱼三代虫的检疫。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）３　概述大西洋鲑鱼三代虫简介参见附录Ａ。４　试剂和材料４．１　水：符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．２　甲醛：分析纯。４．３　乙醇：分析纯。４．４　犜犪狇酶：－２０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。４．５　ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏＬ／Ｌ。４．６　引物：浓度为４０μｍｏｌ／Ｌ。其序列如下：ＩＴＳ１：５’ＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴ３’ＩＴＳ２：５’ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡ３’扩增内部转录间隔区（ＩＴＳ）中的１３００ｂｐ片段，退火温度为５０℃。ＩＧＳ１：５’ＣＴＧＧＣＴＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＧＣ３’ＩＧＳ２：５’ＡＡＧＡＴＡＣＴＣＡＴＴＴＧＡＣＴＣＧＧＴＧＴＧ３’扩增基因间隔区（ＩＧＳ）中的７３８ｂｐ的片段，退火温度为５５℃。ＬＡ：５’ＴＡＡＴＣＧＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＡＡ３’ＨＡ５’ＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＧＣＡ３’扩增线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因中的８９３ｂｐ的片段，退火温度为５０℃。４．７　异丙醇：分析纯，使用前预冷到－２０℃。４．８　矿物油：要求无ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶，用于无热盖的ＰＣＲ扩增仪。４．９　相对分子质量标准。４．１０　其他试剂见附录Ｂ。５　器材和设备５．１　解剖镜。５．２　水浴锅。５．３　恒温箱。１犛犖／犜２１２４—２００８５．４　普通冰箱和超低温冰箱。５．５　台式离心机。５．６　ＰＣＲ扩增仪。５．７　水平电泳仪。５．８　微量移液器。５．９　紫外观察灯或凝胶成像仪。５．１０　制冰机。５．１１　显微镜。６　大西洋鲑鱼三代虫的检查和固定６．１　大西洋鲑鱼三代虫的检查检查时，将鱼放在盛有运输时所用水的容器中，将鱼完全淹没。用针刺鱼脑，将鱼杀死，以免鱼血污染水。将鱼放在具有良好光线的双筒解剖镜下逐条检查，检查鱼的体表，包括鳃和口腔。在缺乏活鱼检查的条件下，用１０％甲醛或８５％乙醇溶液固定鱼体。用甲醛固定的鱼，三代虫标本呈白色；用乙醇固定的鱼，三代虫呈轻微的暗黄色。检查前将装有鱼的容器放在自来水龙头下，让水流轻轻地通过容器冲洗约２ｈ。在冲洗之前，先要分别检查固定鱼所用的固定剂，包括容器底部的沉淀物，看在固定和运输的过程中有无三代虫从鱼的身体上掉下来。６．２　大西洋鲑鱼三代虫的固定先加一滴水到载玻片上，然后将一条寄生虫放到水滴上，轻轻地盖上盖玻片，用一块滤纸在盖玻片的边缘慢慢吸水，直到水基本吸干为止。注意水不要吸得太干，以免压碎虫体。接着滴一小滴ＡＰＧ（见附录Ｂ第Ｂ．１章）到盖玻片的边缘，直至ＡＰＧ溶液浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。在玻片上做好标签，标签上要注明宿主种类、虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。７　大西洋鲑鱼三代虫的形态学鉴定大西洋鲑鱼三代虫的形态测量及形态学描述见表１，并参见附录Ｃ和附录Ｄ。虫体来自鲑的幼鱼和虹鳟，进行虫体测量时的水温在０℃～２０℃之间。表１　大西洋鲑鱼三代虫的边缘小钩、锚钩和腹联结棒中１４种特征数据的总变动范围测量的特征变动范围／μｍ边缘小钩全长３３．０～４６．６边缘小钩柄部长２６．０～３８．５边缘小钩镰部长７．０～９．５锚钩全长５８．０～８５．０锚钩柄部长４２．８～６３．９锚钩尖部长２７．８～４４．２锚钩基部长１５．０～３２．１腹联结棒两凸起间的最大长度１８．５～３３．２腹联结棒长１９．５～３２．０腹联结棒基部总宽度２０．３～３６．５腹联结棒基部宽度７．１～１８．７腹联结棒中间总宽度１７．０～３５．５腹联结棒中间宽度５．０～１５．５腹联结棒膜长１２．５～２３．０２犛犖／犜２１２４—２００８８　大西洋鲑鱼三代虫分子生物学检测８．１　样品处理把样品（约１ｍｇ）从８５％乙醇或甲醛中取出，充分干燥以去除多余的乙醇或甲醛，然后放在０．５ｍＬ的离心管里。管中有９μＬ裂解液（附录Ｂ第Ｂ．２章）。离心管于６５℃作用２０ｍｉｎ，再９５℃加热１０ｍｉｎ。该裂解产物不需要进一步纯化就可直接作为ＰＣＲ的模板。８．２　犘犆犚扩增内部转录间隔区（犐犜犛）基因８．２．１　犘犆犚扩增反应体系为１００μＬ：在０．５ｍＬ反应管中加入ｄＮＴＰｓ２μＬ，引物（ＩＧＳ１和ＩＧＳ２）各２．５μＬ，２５ｍｍｏＬ／Ｌ的氯化镁（ＭｇＣｌ２）（见附录Ｂ第Ｂ．３章）１０μＬ、１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．４章）１０μＬ、犜犪狇酶１μＬ、模板１０μＬ，加水到总体积１００μＬ。如使用无热盖的ＰＣＲ扩增仪，需在反应混合物上覆加５０μＬ矿物油。混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于ＰＣＲ扩增仪。反应程序为９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ、５０℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３５次循环；７２℃保温１０ｍｉｎ。８．２．２　犘犆犚扩增中对照物的设置在８．２．１中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照；设置阳性对照物，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供；取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照；取等体积的水代替模板作为空白对照。８．２．３　琼脂糖电泳用ＴＢＥ（见附录Ｂ第Ｂ．５章）电泳缓冲液配制１．５％的琼脂糖（含１μｇ／ｍＬＥＢ，见附录Ｂ第Ｂ．６章）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将６μＬ样品和６×上样缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．７章）按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。５Ｖ／ｃｍ电泳约０．５ｈ，当溴酚蓝到达底部时停止。８．２．４　结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。ＰＣＲ后阳性对照会出现一条１３００ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。对扩增产物进行测序，参考序列参见附录Ｅ。８．３　犘犆犚扩增基因间隔区（犐犌犛）基因８．３．１　犘犆犚扩增反应体系为１００μＬ：在０．５ｍＬ反应管中加入ｄＮＴＰ２μＬ，引物（ＩＴＳ１和ＩＴＳ２）各２．５μＬ，２５ｍｍｏＬ／Ｌ的氯化镁（ＭｇＣｌ２）（见附录Ｂ第Ｂ．３章）１０μＬ、１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．４章）１０μＬ、犜犪狇酶１μＬ、模板１０μＬ，加水到总体积１００μＬ。混匀后低速离心。如使用无热盖的ＰＣＲ扩增仪，需在反应混合物上覆加５０μＬ矿物油。再将反应管置于ＰＣＲ扩增仪。９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ、５５℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸２ｍｉｎ，３５次循环；７２℃保温１０ｍｉｎ，扩增产物４℃保存。８．３．２　犘犆犚扩增中对照物的设置在８．３．１中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照；设置阳性对照物，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供；取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照；取等体积的水代替模板作为空白对照。８．３．３　琼脂糖电泳同８．２．３。８．３．４　结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。ＰＣＲ后阳性对照会出现一条７３８ｂｐ的３犛犖／犜２１２４—２００８ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。对扩增产物进行测序，参考序列参见附录Ｆ。８．４　犘犆犚扩增线粒体细胞色素氧化酶基因８．４．１　犘犆犚扩增反应体系为１００μＬ：在０．５ｍＬ反应管中加入ｄＮＴＰ２μＬ，引物（ＬＡ和ＨＡ）各２．５μＬ，２５ｍｍｏＬ／Ｌ的氯化镁（ＭｇＣｌ２）（见附录Ｂ第Ｂ．３章）１０μＬ、１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．４章）１０μＬ、犜犪狇酶１μＬ、模板１０μＬ，加水到总体积１００μＬ。混匀后低速离心。如使用无热盖的ＰＣＲ扩增仪，需在反应混合物上覆加５０μＬ矿物油。再将反应管置于ＰＣＲ扩增仪。９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ、５０℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸２ｍｉｎ，３５次循环；７２℃保温１０ｍｉｎ，扩增产物４℃保存。８．４．２　犘犆犚扩增中对照物的设置在８．４．１中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照；设置阳性对照物，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供；取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照；取等体积的水代替模板作为空白对照。８．４．３　琼脂糖电泳同８．２．３。８．４．４　结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。ＰＣＲ后阳性对照会出现一条８９３ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。对扩增产物进行测序，参考序列参见附录Ｇ。９　综合判定９．１　如果在大西洋鲑鱼或者虹鳟的鳍条或者体表肉眼观察到虫体或者显微镜观察到虫体，则判断为可疑。９．２　如果对虫体进行形态学鉴定，并用ＰＣＲ方法中的任一对引物扩增出阳性判断，并经测序分析与大西洋鲑鱼三代虫的基因序列相似性最高，则可确诊为大西洋鲑鱼三代虫感染。４犛犖／犜２１２４—２００８附　录　犃（资料性附录）大西洋鲑鱼三代虫简介　　大西洋鲑鱼三代虫隶属于单殖亚纲三代虫科，它是二龄以内野生和养殖鲑鱼（犛犪犾犿狅狊犪犾犪狉Ｌ．）的重要病原。它还能感染其他的鲑鳟鱼类，如虹鳟（犗狀犮狅狉犺狔犮犺狌狊犿狔犽犻狊狊）、北极红点鲑（犛犪犾狏犲犾犻狀狌狊犪犾狆犻狀狌狊）、溪红点鲑（犛．犳狅狀狋犻狀犪犾犻狊）、鱼（犜犺狔犿犪犾犾狌狊狋犺狔犿犪犾犾狌狊）、湖红点鲑（犛．狀犪犿犪狔犮狌狊犺）和鳟鱼（犛犪犾犿狅狋狉狌狋狋犪）。大西洋鲑鱼三代虫仅分布于欧洲。在欧洲的一些国家（主要是北方）的人工养殖鲑和虹鳟中都发现有大西洋鲑鱼三代虫。俄罗斯、瑞典和挪威的河流中的野生鲑鱼幼鱼中也有大西洋鲑鱼三代虫的寄生。大西洋鲑鱼三代虫在养殖鲑鳟鱼中特别是在虹鳟中无症状感染可能已有多年。单个寄生虫的感染较为常见的，因此在监测三代虫的发生时需要一套特殊的程序。应在解剖镜下检查鱼的全部体表，包括鳃和口腔。当大西洋鲑鱼三代虫寄生于野生或人工养殖鲑的幼鱼或小鱼时，往往会导致三代虫病。该病的发生没有时间和温度限制，但在春季和水温在７℃～１７℃之间时更常见一些。鱼的鳍条，特别是背鳍和胸鳍是最常见的寄生部位，此外还可寄生在鱼的体表，包括鼻孔、鳃和口腔。在患三代虫病的鱼体上，往往可以在鳃、皮肤或鳍条的刮取物中看到三代虫；然而当三代虫的数量少时，用这种方法监测到该种寄生虫的机会就比较有限。大西洋鲑鱼三代虫在形态学上和从褐鳟、大西洋鲑和虹鳟身上的犌．狋犲狌犮犺犻狊和从河鳟身上的犌．狋犺狔犿犪犾犾犻十分相似。这些种的差别在于边缘小钩镰的形状。犌．狋犲狌犮犺犻狊的钩镰要长而且更弯，犌．狋犺狔犿犪犾