基础学习实验-8-目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定

目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定分析综合性设计性实验-8此实验共包括如下六个部分1.第一部分，目的基因选择2.第二部分，PCR引物设计3.第三部分，PCR实验操作4.第四部分，PCR产物电泳鉴定5.第五部分，PCR产物测序鉴定6.第六部分，目的基因序列变异分析PCR技术的发明PCR与临床诊断第一部分，目的基因选择候选基因简介在本实验中，有三个候选基因，分别是NGAL，Fascin和Ezrin。这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表SCI收录研究论文20余篇，已形成系列优势。同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做PCR实验。NGAL（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin)家族的一个成员。NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。NGAL的mRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有BC033089和NM_005564等，编码区长为597bp，编码198个氨基酸，包含了N端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60bp）。NGAL基因NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：前20个AA为信号肽序列2001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系SHEE和食管癌细胞系SHEEC互为对照，用cDNA微列阵进行筛选，用RNA印迹和RT-PCR进行鉴定，cDNA克隆测序后与GenBank进行BLAST分析比较。结果表明NGAL基因在SHEEC中出现显著差异过表达，其cDNA序列与小鼠24p3、大鼠NRL(neu-relatedlipocalin)和人中性粒细胞NGAL具有较高的相似性。这提示NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。AB利用cDNA芯片筛选两种细胞的差异表达基因A.永生化食管上皮细胞系SHEEB.食管癌细胞系SHEECABC反转录PCR检测NGAL在两种细胞的mRNA水平A.永生化食管上皮细胞系SHEEB.食管癌细胞系SHEECC.100bpDNAmarkerFascin蛋白的mRNA全长为2767bp，由5‘端非翻译区111bp碱基，3’端非翻译区1174bp碱基，1482bp的全编码序列区和6个PloyA信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约为55kD。Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘的丝状伪足(filopodia)、微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。以往研究发现，Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌AGS、大肠癌LM1215和SW480、胰腺癌BxPC3和T3H4等细胞系中均上调表达。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。Fascin基因ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascin基因的编码区序列Fascin基因的蛋白序列Fascin蛋白的三级结构：由4个β-三叶草结构组成，含多个β折叠我们课题组发现，在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化中，Fascin基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到Fascin蛋白呈阳性表达。Fascin在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们设计并合成了靶向Fascin基因的siRNA，试图通过RNA干扰的方法减少Fascin基因的表达，从而探讨Fascin对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。扫描电镜结果显示抑制Fascin表达后，EC109细胞突触形成明显减少。细胞免疫荧光结果显示代表Fascin蛋白的绿色荧光在被干扰细胞（A）中要比对照细胞（B）的弱ABEzrin基因Ezrin为ERM（Ezrin,radixin,moesin）蛋白家族成员之一，ERM家族成员大多位于丝状突和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。ERM家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用参与细胞粘附作用降。ERM家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过Rho-GTP酶参与信号转导。Ezrin含有585个氨基酸，等电点为6.15，理论分子量为69kD。Ezrin分子带有大量电荷（38.5%的氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因（Ezrin实际分子量为80kD）。Ezrin定位与染色体6q25.2-q26，DNA长度为1761个碱基，含13个外显子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTA