小鼠MCAO手术造模步骤

10%水合氯醛溶液，中南大学湘雅三医院；XTL-400连续变倍体视显微镜，重庆澳浦东光电技术有限公司；单极微手术电凝器，武汉春光医疗美容仪器有限公司；眼科器械（眼科弯镊、眼科直镊、眼科剪、眼科钳等），视卓医疗器械有限公司；医用缝合针，巢湖市宾雄医疗器械有限公司；医用真丝编织线（5M灭菌线团），规格2-0、4-0、5-0，上海浦东金环医疗用品股份有限公司；碘伏；浓度75%医用酒精；医用棉签；手术刀片；剃须刀片；小鼠解剖台；组织剪；组织镊；止血钳；持针钳；微型动脉夹；1mL一次性注射器；特制的栓线；电子秤；红外灯等。实验方法：采用改良的ZeaLonga法，本法改良之处在于不暴露翼腭动脉（PPA,pterygopalatineartery），而颈内动脉（ICA,internalcarotidartery）通过悬挂编织线以及夹动脉夹的方式阻碍其血流，最后从颈外动脉（ECA,externalcarotidartery）插入栓线。实验步骤：1、对禁食一晚的C57BL/6小鼠称重，以10%水合氯醛溶液按照0.004mL/g小鼠体重的量对小鼠进行腹腔注射麻醉。提前准备好用于结扎或阻断动脉的编织线，于生理盐水中浸润。2、数分钟后，若小鼠不能自由翻身则认为已达到麻醉深度要求，将小鼠绑缚于解剖台上，在小鼠颈下塞以棉签垫高，碘伏消毒小鼠颈部并备皮。3、沿小鼠颈部正中剪开皮肤，用眼科弯镊和眼科直镊在体视显微镜放大视野下钝性分离皮下组织和脂肪，划开浅肌膜和颈阔肌，暴露出颈深肌膜和气管前肌。4、分离到气管前肌后，在右侧胸锁乳突肌前缘撕开颈深肌膜，显露胸锁乳突肌并将其拉向后侧，沿胸锁乳突肌向下继续分离，直到暴露较深位置的颈动脉鞘。5、在避免压迫小鼠气管的同时，划开颈动脉鞘，分离出颈总动脉（CCA,commoncarotidartery）并穿线以活结阻断血流，注意不要伤害到鞘内伴行的颈内静脉与迷走神经，对神经的刺激或损伤可能引起小鼠呼吸骤停。6、沿颈总动脉向上分离，于甲状软骨上缘处分出颈外动脉，颈外动脉位于颈内动脉的上方内侧，靠近气管。在颈总动脉分为颈内动脉和颈外动脉处有颈动脉窦和颈动脉小球。颈动脉窦为颈总动脉末端和颈内动脉起始处的膨大部分。7、从颈外动脉起始处前内侧壁发出的小分支为甲状腺上动脉，分离后电凝烧断。继续沿颈外动脉向上分离可发现第二分支舌动脉，以及枕动脉和颌外动脉。在靠近枕动脉与颌外动脉分支处以编织线进行双重结扎，在两结扎处中间剪断颈外动脉，近心端结扎线稍微留长以方便之后插栓。8、稍提起颈外动脉的近心端结扎线，暴露下方外侧的颈内动脉。颈内动脉入颅前分为两支，位于外侧的翼腭动脉和位于内侧的颈内动脉入颅支。为减少建模手术时间和对小鼠的损伤，可以不分离翼腭动脉，只需在颈内动脉下穿线以便在插入栓线时悬线阻碍自颈内动脉的血流。9、在颈外动脉的近心端另外备一活结，暂不系紧，待栓线插入至指定位置之后系紧以固定栓线。轻轻提起颈外动脉的近心端结扎线，使颈外动脉与颈内动脉方向一致。悬提颈内动脉下的编织线并以微型动脉夹暂时夹住以控制血流。用眼科剪在颈外动脉的近心端剪一小口，挑选线头圆润、线身光滑、粗细均匀适宜的栓线从小口处轻轻插入，栓线会从颈外动脉穿过分叉处进入颈内动脉。注意当栓线进入颈内动脉时应稍稍下压使栓线头端翘起，这样可避免将栓线插入翼腭动脉。不建议分离或结扎翼腭动脉是因为阻断翼腭动脉后易形成颈内动脉内血栓，血栓包裹在栓线周围会对拔栓造成困难，不易于模型的再灌流。10、当栓线插入到9-10mm左右时会遇到轻微阻力，这表明栓线已经插入到大脑前动脉（ACA,anteriorcerebralartery）与大脑中动脉（MCA,middlecerebralartery）的分叉处，阻塞了大脑中动脉主干的起始部。至此不要再继续插入，插入过深可能会使栓线刺破ACA并诱发蛛网膜下腔出血（SAH,subarachnoidhemorrhage）导致建模失败甚至小鼠死亡。若栓线插入深度在6mm左右时已感到较大阻力，说明栓线可能过粗无法入颅，或者可能误插进翼腭动脉，此时不可蛮力插栓，应将栓线稍稍退出更换角度后再尝试插入颈内动脉的入颅支。11、将栓线插入到指定位置后，把颈外动脉的近心端上所备活结系紧固定栓线。解开阻断颈总动脉的活结，最后缝合皮肤，以碘伏消毒缝合处，将小鼠放回笼内。12、术后以红外灯照射小鼠保暖并监测小鼠体温，注意笼中保持干燥，无积水或粉尘，防止小鼠误吸窒息。13、两小时之后，剪开缝线，拔出栓线并结扎颈外动脉断端，恢复小鼠的脑血灌流，然后重新缝合消毒，将小鼠放回笼内继续监护。14、小鼠醒后参照Bederson等、ZeaLonga等人的五级4分评分法对模型进行脑损评分。0分：未见神经病学征象，即无神经功能缺损症状；小鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直；置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动的阻力相等。1分：轻微神经功能缺损；小鼠被提尾悬空时由于缺血对侧前肢力弱，呈屈曲、抬高、肩部内收，肘关节伸直，同时身体也会转向缺血对侧；置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动的阻力相等。2分：中度局灶性神经功能缺损；小鼠爬行时向缺血对侧转圈；置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动的阻力不等，缺血对侧的侧向推动阻力明显降低。3分：重度局灶性神经功能缺损；缺血对侧肢体不能承受体重，小鼠站立时向缺血对侧倾倒。4分：严重神经功能缺损；无自主活动、意识障碍或呈筒样滚动。选取其中脑损评分为2-3分的小鼠为合格模型，进入后续实验内容。0-1分，或无神经功能缺损与轻微神经功能缺损可能是因为对MCA的阻塞不够；4分，或严重神经功能缺损可能是因为插栓过深诱发SAH。15、将成功的小鼠模型单独分笼饲养，每日观察记录。