果胶裂解酶活力测定方法

果胶裂解酶活力测定方法1定义在测定条件下，每分钟作用果胶产生1µmol双键所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。2原理果胶裂解酶作用果胶产生不饱合寡聚半乳糖醛酸。反应产物分子中C－4和C－5之间有一与C－5上羧基相连的双键，使之在235nm波长有最大吸收。分子消光系数为5500cm2/mmol。3试剂3.1琥珀酸钠（C4H4O4Na2·6H2O）3.3浓盐酸（HCL）3.2琥珀酸（C4H6O4）3.4果胶（Sigma公司，P9135）本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。4仪器和设备4.1实验室常用仪器设备。4.6秒表（数字显示）4.2恒温水浴：（30±0.5℃）。4.7分析天平（0.0001g）4.3分光光度计（波长范围200-1000nm）4.8磁力搅拌器。4.4移液管4.9离心机：转速为30000r/min以上。4.5酸度计：精确至小数点后2位。5溶液5.10.05mol/L，pH=5.2琥珀酸缓冲液称取琥珀酸钠（C4H4O4Na2）13.51g于900ml水中，溶解后用琥珀酸（C4H6O4）调pH值至5.2，定容至1000ml，校正pH值后置冰箱中备用。5.22mol/L盐酸准确量取16.7ml浓盐酸，用水定容至100ml。5.30.425%果胶溶液（底物）称取0.425g果胶于80ml缓冲液中，至少搅拌3h，溶解后于4℃放置16h，30000rpm/min离心30min，用缓冲液定容至100ml,4℃保存。6分析步骤：6.1待测酶液的制备6.1.1根据酶活力确定稀释倍数，使酶浓度控制在大约0.06-0.09u/mL,即光吸收值在0.25—0.40范围内。6.1.2称取酶粉1g，精确至0.0001g，（或吸取酶液1.00ml）。用蒸馏水溶解，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，全部移入容量瓶中，稀释倍数小于500倍的直接用缓冲液(5.2)溶解。4000rpm/min离心5分钟，上清液液根据稀释倍数再进行稀释，最后一次用缓冲液稀释，供测试用。6.1.3酶液在4小时以后必须重新称量，稀释。6.2测定：按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(5.3)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致,30℃水解30min.反应步骤及试剂、溶液用量见下表:顺序试样空白1加底物(5.3)2.9mL加底物(5.3)2.9mL230℃预热3分钟30℃预热3分钟3加酶液0.1mL30℃水解30min4混合加盐酸（5.2）1mL530℃水解30min混合6加盐酸（5.2）1mL加酶液0.1mL7混合混合8空白调零后，235nm下测定235nm调零7计算：则，X＝A×1000×4×Fu/ml(g)30×0.1×5500式中：A－光吸收值；1000－mmol与µmol之间的换算关系；4－反应总体积（ml）；F－酶样品稀释倍数；30－反应时间（min）；0.1－测定所取酶溶液量（ml）；5500－分子消光系数。8结果的允许差：平行试验相对误差不得超过5%。