Northern印迹杂交技术

分子生物学方法之Northern印迹杂交技术原理•核酸分子杂交（molecularhybridization）：利用不同来源但互补配对的核酸单链之间(包括DNA-DNA,DNA-RNA，RNA-RNA)能够特异性结合形成杂合双链的特性，从而对目的核酸分子进行定性和定量分析的技术。•NorthernBlotting:检测RNA•Northern杂交是用于RNA定量和定性分析的常用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。•可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。northern印迹杂交流程图所用材料、试剂及仪器方法与步骤参考书籍及文献材料总RNA样品或mRNA样品、探针模板DNA、随机引物、地高辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜等。试剂•10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、20*ssc(pH7.0)杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液(2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝)、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)、TE缓冲液、显色液、琼脂糖等。仪器•恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯，量筒，三角瓶，紫外灯等。1.RNA电泳琼脂糖与纯水一定比例于微波炉内混匀、冷却到75°C加mops缓冲液、甲醛，混匀。制备成电泳用胶待胶凝过程中，准备RNA样品。上样电泳：用1*MOPS缓冲液，先用20V使样品进胶，再用5V/cm电泳1h，停止电泳。切去凝胶一角，用用SSC冲洗并浸泡胶板，以除去甲醛。用标尺测量加样孔与条带的距离，拍照2.转膜浸泡在250ml50Mmol/lNaOH,室温、30r/min30min。浸泡在250mltris*NaCI室温、30r/min30min。浸泡在250ml10*SSC约1min。RNA转膜前的处理毛细管洗脱法真空转移法电印迹法转膜的方法叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约10h。电泳后的凝胶→放置→室温转移10—25h→漂洗（SSC）除碎胶片→80℃烘烤2h固定核酸.3、探针标记探针模模板、随机引物、双蒸水。离心、混匀。变性冰块顺序加随机引缓冲液、dNTP、dUTPKlenow酶，混匀。室温3h75°C保温10Min。加预冷无水乙醇、混匀。-20℃、2h1000r/min15min、去上清、乙醇洗涤、真空干燥、TE溶解、-20°C备用。4.杂交•将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交液、68℃水浴摇床杂交1-2h。•将标记好的DNA探针煮沸5min，迅速在冰上冷却。将探针加入预热的杂交液中，充分混匀。•倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计算向杂交袋中加入含地高辛标记探针的杂交液，68℃杂交6h以上。•洗膜：在室温下用50mL2*SSC，0.1%SDS溶液洗膜两次以上，每次5min。膜即可以立即用于显色检测或储存备用（干燥环境中）。5.酶联免疫染色•室温，用缓冲液Ⅰ洗膜1-5min，缓冲液Ⅱ洗膜30min，再用缓冲液Ⅰ洗膜1-5min。•用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000），稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12h。室温下将膜在抗体稀释液中浸泡30min。•缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15min，以除去未结合的抗体复合物。再用20mL缓冲液Ⅲ平衡膜2-5min。•在黑暗条件下将膜与显色液放入密封的暗盒中显色。通常2min后出现颜色，充分显色应在16h以上。膜可以在弱光下短时间暴露以检测显色强度。•显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照相记录显色结果。结果示例参考书籍及文献[1]朱玉贤,李毅.现代分子生物学[M].高等教育出版社,2002，173-178.[2]黄怡森,张光毅.生化与分子生物学[M].科学出版社，2008，345-347.[3]郝福英,朱玉贤,朱圣庚，等.分子生物学实验技术[M].北京大学出版社,1998,68-72.[4]魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版社,2006,156-162.[5]汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.