NYT 1750-2009 甜菜丛根病的检验 酶联免疫法

Ⅰ中华人民共和国农业行业标准NY/T1750—2009甜菜丛根病的检验酶联免疫法DeterminationofrhizomaniainsugarbeetELISAmethod2009-04-23发布2009-05-20实施ICS65．020B16华国国国中人民共和部发布NY/T1750—2009Ⅰ前言本标准由中华人民共和国国国部种植国管理司提出并归口。本标准起草单位：国国部甜菜品质监督检验测试中心。本标准主要起草人：马龙彪、吴玉梅、张福顺、王皙玮、张玉霜、李成玉。NY/T1750—20091甜菜丛根病的检验酶联免疫法1范围本标准规定了甜菜丛根病的检验方法。本标准适用于甜菜植株丛根病的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括堪误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。甜菜丛根病rhizomania由甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)侵染，以甜菜多黏菌(Polymyxabetae)为传播介体的一种土传病害，致使甜菜块根外表形成不规则纤细根群，象胡须一样。4原理在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量呈正比，根据颜色反应的深浅进行定性分析。5试剂和材料除非另有说明，本标准所用试剂，均指分析纯试剂；所使用的水符合GB／T6682中规定的三级水规定。5．10.5mol／L盐酸溶液：取浓盐酸(HCl)45mL用水定容至1000mL。5．21.0％氢氧化钠(NaOH)溶液：称取1g氢氧化钠(NaOH)，用水定容至100mL。5．3包被缓冲液(pH9.6)：分别准确称取无水碳酸钠(Na2CO3)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g，叠氮化钠(NaN3)0.20g，然后在900mL水中溶解，用0.5mol／L盐酸溶液(5．1)调节pH至9.6，用水定容至1000mL。5．4PBS磷酸缓冲液(pH7.4)：分别称取氯化钠(NaCl)8.0g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g，氯化钾(KCl)0.2g，叠氮化钠(NaN3)0.2g，然后在900mL水中溶解，用1.0％氢氧化钠溶液(5．2)或0.5mol／L盐酸溶液(5．1)调节pH为7.4，用水定容至1000mL。5．5PBS-Tween(PBST)缓冲液：吸取0.5mL吐温-20，用溶液PBS磷酸缓冲液(5．4)定容至1000mL。5．6样品提取缓冲液：称取聚乙烯吡咯烷酮(C6H9NO)n2.0g，用PBS-Tween(PBST)缓冲液(5．5)溶解，并定容至100mL。NY/T1750—200925．7连接缓冲液：称取聚乙烯吡咯烷N(C6H6NO)n2.0g，卵蛋白质2.0g,用PBS-Tween(PBST)缓冲液(5．5)60mL溶解，并定容至100mL。5．8底物缓冲液：称取叠氮化钠(NaN3)0.2g，在600mL水中溶解，加入二乙醇胺(C4H11NO2)97mL，用0.5mol／L盐酸溶液(5．1)调节pH为9.8，用水定容至1000mL。5．9试剂组成5．9．1阳性对照物。5．9．2阴性对照物。5．9．3一抗IgG。5．9．4二抗IgG-AP。5．10抗体(IgG)溶液配制：用包被缓冲液(5．3)根据一抗IgG说明进行稀释。5．11酶标抗体(IgG-AP)溶液配制：用包被缓冲液(5．3)根据二抗IgG-AP说明进行稀释。5．121mg／mL4-硝基苯磷酸盐配制：准确称取4硝基苯磷酸盐(C6H4NNa2O6P)0.1g，用底物缓冲液(5．8)溶解，并定容至100mL。6仪器和设备6．1恒温箱。6．2分析天平：感量为0.0001g。6．396孔酶标板。7分析步骤7．1样品制备取甜菜须根，洗净，称取0.1g，加1.0mL样品提取缓冲液(5．6)，在研钵上研磨至均匀悬浮状备用。7．2实验步骤7．2．1在酶标板中每孔加入200µL抗体溶液(5．10)，在37℃下保持2h～4h。7．2．2用PBS磷酸缓冲液(5．4)冲洗(可使用洗板机)3次(每次浸泡几分钟)，将酶标板倒扣在滤纸上，轻敲吸干。7．2．3在每个孔中加入200µL检测样品，2次重复，同时做阴性对照、阳性对照以及样品空白，在4℃下过夜。7．2．4重复步骤7．2．2，加入酶标抗体溶液(5．11)200µL，在37℃下温育4h。7．2．5重复步骤7．2．2，加入4-硝基苯磷酸盐溶液(5．12)200µL，室温下30min～60min,或延长至理想反应结果，目测结果。8结果的表述根据酶标板的显色反应，进行结果判定。显色反应中，阳性对照为黄色，若检测样品呈现黄色即为含有甜菜坏死黄脉病毒，可以定性为该检测样品感染甜菜丛根病。使用购买的甜菜丛根病ELISA检验试剂盒进行检验，按照试剂盒的说明进行。