SN∕T 3507-2013 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法

书书书!中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$%#&!进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别$%&法和实时荧光$%&法’()*+,-,./+,0*0-./123)4)/*(5006,*+)7+,6)1-04,3804+/*()7804+$%&3)+20(/*(4)/69+,3)-6:04)1.)*.)$%&3)+20(%#&!9#!9#&发布%#&!9#’9&(实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#请注意本文件的某些内容可能涉及专利#本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出#本标准起草单位$中华人民共和国福建出入境检验检疫局#本标准主要起草人$邵碧英%林志武%陈文炳%缪婷玉%彭娟%柯家骥#!!!#!#$%#&!进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别$%&法和实时荧光$%&法&!范围本标准规定了纺织品中山羊绒%绵羊毛鉴别的)*+和实时荧光)*+方法#本标准适用于纺织品中山羊绒%绵羊毛)*+法和实时荧光)*+法的定性鉴别#%!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本’包括所有的修改单(适用于本文件#!!#,,-&!分析实验室用水规格和试验方法!!#$(.(/%&!转基因产品检测!实验室技术要求!!术语和定义下列术语和定义适用于本文件#!%&聚合酶链式反应!’()*+,-./,01.23-,.042(3)$%&一种模拟天然012复制的体外扩增法&在012聚合酶催化下&以母链012为模板&以特定引物为延伸起点&以.种单核苷酸’31#)(为底物&通过变性退火延伸的循环反应&使极少量的012的特定片段&在短短几小时内扩增上百万倍#!%%实时荧光$%&!-,.)542+,6)7(-,/0,30,$%&在)*+反应体系中加入荧光基团&利用荧光信号积累实时监测整个)*+进程&最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法#’!缩略语下列缩略语适用于本文件#45$碱基对’4678569:(*;值$每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数’=8;?:87?@3(012$脱氧核糖核酸’38@A=:94@BC89693(0##$二硫疏糖醇#31#)$脱氧核苷酸三磷酸’38@A=:94@BC8@7938;:95?@75?6;8(!原理用试剂盒法提取样品012#针对山羊%绵羊的线粒体012序列设计引物和探针&通过单一)*+%实时荧光)*+技术&对012中的山羊成分%绵羊成分分别进行特异性扩增&根据实验结果&判定该样品中是否含有山羊绒%绵羊毛#$!!#!#$%#&!(!试剂(%&!实验用水应符合!!#,,-&中一级水的规格#(%%!组织和毛发提取试剂盒’与012DE#F系统结合使用($参见附录2中2%$#$((%!!&G!#)*+F67;8:F9A$’H$I!J!#012聚合酶&/’’K@!J31#)&&’KK@!J#:97LM*’5M-HN(&$’’KK@!JO*&NKK@!JFP*&&其他稳定剂和增强剂&Q&’R保存#(%’!$%&’()*)!##F’)8:S8;+86#9K8(’&G($见2%&#(%!(/T或$’’T乙醇#(%(!琼脂糖#(%$!溴化乙锭#(%)!012K6:U8:#(%*!#V溶液’5M-%’(#(%&#!/G#V缓冲液#$!仪器与设备$%&!冰箱$.R#Q&’R#$%%!天平$感量’%’’$P#$%!!分析研磨机#$%’!剪刀#$%!微孔干浴器或水浴锅#$%(!瞬时离心机#$%$!涡旋仪#$%)!$%/KJ磁分离架#$%*!微量可调移液器及枪头$$’J%&’J%$’’J%&’’J%$’’’J#$%&#!$%/KJ离心管#$%&&!)*+薄壁管#$%&%!实时荧光)*+光学反应管#$%&!!超净工作台#$%&’!)*+仪#$%&!实时荧光定量)*+仪#$%&(!电泳装置#$%&$!凝胶成像仪#)!取样纱线$从不同的管纱%筒纱或绞纱上随机取样&共取约$P的纱样#织物$从不同位置剪取&共取约$P的织物#$(!给出这一信息是为了方便本标准的使用者&并不表示对该产品的认可#如果其他等效产品具有相同的效果&则可使用这些等效产品#&!!#!#$%#&!*!制样用剪刀将样品剪碎&经分析研磨机打散%混匀&再用剪刀尽量剪碎至纤维长度&KK#NKK&再次用分析研磨机混匀#&#!89的提取&#%&!称取约/KP试样&放入$%/KJ离心管中&每个样平行提取&管&加$’’J0##’$K@!J(和W/J蛋白酶O储存液&混匀&/,R温浴过夜#&#%%!加N/’J裂解液&上下颠倒混匀&瞬时离心&将上清液移至新的$%/KJ离心管中#&#%!!加WJ完全悬浮的012DE#F树脂&高速涡旋振荡N7&室温放置$’K9B#&#%’!将离心管高速涡旋振荡&7&将离心管置于磁分离架上#&#%!待磁珠完全吸附至管壁后&小心吸去溶液&加入$’’J裂解缓冲液&高速涡旋振荡&7&将离心管置于磁分离架上#&#%(!吸去裂解液&加入$’’J$G洗涤液&高速涡旋振荡&7&将离心管置于磁分离架上&加$’’J洗液重复洗涤N次&尽可能吸尽最后一次的洗涤液#&#%$!打开盖子&风干/K9B#&#%)!加入W’J洗脱液&高速涡旋振荡&7&,/R温浴/K9B#&#%*!取出离心管&高速涡旋振荡&7&置于磁分离架上&小心吸取溶液’即012溶液(于新的$%/KJ离心管中&Q&’R保存备用#&&!89的鉴别&&%&!质量控制进行)*+%实时荧光)*+鉴别时设置阳性对照%阴性对照和空白对照#阳性对照$扩增山羊成分时用山羊绒012&扩增绵羊成分时用绵羊毛012#阴性对照$扩增山羊成分时用非山羊绒012&扩增绵羊成分时用非绵羊毛012#空白对照$实验用水#&&%%!$%&法&&%%%&!引物所用引物信息见表$&用#V溶液’5M-%’(稀释至$’K@!J&Q&’R保存备用#表&!$%&扩增所用引物扩增成分引物名称引物序列退火温度R产物大小45内参基因*=;LX*=;L+/*L!*!!2#2*!*22#*##2*!2#*22LN*/*L*#!!!#**#**22##*2#!#!2!LN*/.$(/山羊$&Y!LX$&Y!L+/*L*!***#**222#*22#22LN*/*L*#2#2!#!#2#*2!*#!*2LN*/.NN’N!!#!#$%#&!表&’续(扩增成分引物名称引物序列退火温度R产物大小45绵羊$&YYLX$&YYL+/*L2#2#*22**2*2*!2!2!!2!2*LN*/*L###222*#!!2!2!#!!!2!2LN*/&$W.&&%%%%!$%&反应体系&G!#)*+F67;8:F9A$&H/J&$’K@!J引物各’H/J&012模板/J&33M&Z,H/J#&&%%%!!$%&反应条件(.R&/K9B)(.R&N’7&退火温度’表$(&N’7&W&R&N’7&.’个循环)W&R&/K9B#注$不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整#&&%%%’!$%&产物的检测将适量/G#V稀释成’%/G#V溶液&配制&%’T琼脂糖凝胶#取$/J)*+产物&点样进行电泳&并加012K6:U8:点样以判断)*+产物的片段大小#电压大小根据电泳槽长度来确定&一般控制在N[!K#/[!K长度&电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定#电泳结束后&将凝胶置溴化乙锭溶液’$’P!J(中浸泡N’K9B#用凝胶成像系统观察%拍照%记录与分析电泳结果#&&%%%!$%&结果及判断阳性对照出现预期大小的扩增条带&阴性对照和空白对照均未出现条带)待测样品未出现预期大小的扩增条带&判断结果为阴性#待测样品出现预期大小的扩增条带&判断结果为可疑阳性&需进一步确证#&&%%%(!结果确证实验可疑阳性结果的&可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序&所获得的序列与附录中的相应序列进行比对&同源率达$’’T&可确证为阳性结果&或采用实时荧光)*+法进行确证#&&%!!实时荧光$%&法&&%!%&!引物及探针所用的引物%探针见表&&用#V溶液’5M-%’(稀释至$’K@!J&Q&’R保存备用#表%!实时荧光$%&所用引物%探针扩增成分引物名称引物序列退火温度R产物大小45内参基因$&YLX$&YL+$&YL)/*L222!!2*##!!*!!#!*##LN*/*L!!!###!*#!22!2#!!*!LN*/*LX2FL#2!2!!2!**#!##*#2#22#*!2#222****!L#2F2+2LN*,’$W$.!!#!#$%#&!表%’续(扩增成分引物名称引物序列退火温度R产物大小45山羊$&Y!LX$&Y!L+$&Y!L)/*L*!***#**222#*22#22LN*/*L*#2#2!#!#2#*2!*#!*2LN*/*LX2FL2*!#!##222!*2*#2*2#*L#2F2+2LN*/.NN’绵羊$&YYLX$&YYL+$&YYL)/*L2#2#*22**2*2*!2!2!!2!2*LN*/*L###222*#!!2!2!#!!!2!2LN*/*LX2FL222**22!2#2#2!*##22##L#2F2+2LN*/&$W.&&%!%%!$%&反应体系$%&’()*)!##F’)8:S8;+86#9K8(’&G($&H/J&$’K@!J引物%探针各’HW/J&+Z\+8S8:8B80=8$’/’G(’H/J&012模板/J&33M&Z.HW/J#注$+Z\+8S8:8B80=8$’/’G(适用于2DW/’’%W/’’X67;实时荧光)*+系统&其他型号的荧光)*+仪请参照说明书操作#&&%!%!!$%&反应条件(/R&N’7)(/R&/7&退火温度’表&(&N/7&.’个循环#注$不同仪器可根据仪器要求和$%&’()*)!##F’)8:S8;+86#9K8(使用说明书将反应参数作适当调整#&&%!%’!结果分析反应结束后&应设置无效基线范围#基线范围选择在N#$/个循环&如果有强阳性样本&应根据实际情况调整基线范围#阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点&且*;值].’为准#设置阈值后&分析样品的检测结果#&&%!%!结果判断待测样品山羊成分%绵羊成分检测*;值大于或等于.’&内参照基因检测*;值在&’#N’之间者&阴性对照%阳性对照和空白对照结果正常者&则可判定该样品未检出山羊成分%绵羊成分#待测样品山羊成分%绵羊成分检测*;值小于或等于N,&内参照基因检测*;值在&’#N’之间者&阴性对照%阳性对照和空白对照结果正常者&则可判定该样品检出山羊成分%绵羊成分#待测样品山羊成分%绵羊成分检测*;值在N,#.’之间&应重做实时荧光)*+扩增#再次扩增后的结果*;值仍小于.’者&且阴性对照%阳性对照和空白对照结果正常&则可判定该样品检出山羊成分%绵羊成分)再次扩增后结果*;值大于.’&且阴性对照%阳性对照和空白对照结果正常&可判定该样品未检出山羊成分%绵羊成分#/!!#!#$%#&!&&%’!结果表述&&%’%&!未检出山羊绒%绵羊毛#&&%’%%!检出山羊绒%绵羊毛#&%!防止污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施参照!!#$(.(/%&#,!!#!#$%#&!附!录!9’资料性附录(试剂盒及试剂!!9%&!组织和毛发提取试剂盒’与89:;#系统结合使用(’推荐使用$-(+,=.公司产品(9%&%&!组成’&##次(温育缓冲液’9BC46;9@B4CSS8:(!!!!/’KJ蛋白酶O’5:@;89B678O($’’KP二硫疏糖醇’0##(/%’P&G洗涤缓冲液’^67?4CSS8:(N’KJ裂解缓冲液’=7974CSS8:(.’KJ洗脱液’8C;9@B4CSS8:($/KJ树脂’:879B(’%(KJ9%&%%!试剂配制9%&%%%&!蛋白酶储存液向冻干的蛋白酶O瓶中加入/%/KJ温育缓冲液&轻摇