您好,欢迎访问三七文档
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖/犜2754.2—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(犔犃犕犘)检测方法第2部分:大肠杆菌犗157犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犘犪狉狋2:犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻犗15720110225发布20110701实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法》共分为15个部分:———第1部分:金黄色葡萄球菌;———第2部分:大肠杆菌O157;———第3部分:志贺氏菌;———第4部分:单核细胞增生李斯特菌;———第5部分:副溶血性弧菌;———第6部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌;———第7部分:空肠弯曲菌;———第8部分:肺炎克雷伯氏菌;———第9部分:溶血性链球菌;———第10部分:产气荚膜梭菌;———第11部分:产霍乱毒素的霍乱弧菌;———第12部分:溶藻弧菌;———第13部分:创伤弧菌;———第14部分:假结核耶尔森氏菌;———第15部分:阪崎肠杆菌。本部分为SN/T2754的第2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人:郑文杰、刘伟、张敏爱、张宏伟、易敏英、侯丽萍、蔡国瑞、张霞、曾静、李志勇、孙慈惠、凌莉、曹以诚、高东微。Ⅰ犛犖/犜2754.2—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(犔犃犕犘)检测方法第2部分:大肠杆菌犗1571 范围SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中大肠杆菌O157的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。本部分适用于出口食品中大肠杆菌O157的筛选检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.6 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB19489 实验室 生物安全通用要求GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 生物安全措施为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员检测大肠杆菌O157,所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。4 防污染措施防止污染措施应符合GB/T27403的规定。5 缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甘氨酸三甲内盐犅狊狋酶[犅狊狋DNApolymerase(largefragment)]:犅狊狋DNA聚合酶(大片段)DNA(deoxyribonucleicacid):脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid):乙二胺四乙酸LAMP(loopmediatedisothermalamplification):环介导恒温核酸扩增TritonX100:聚乙二醇辛基苯基醚6 技术概要根据大肠杆菌O157的狉犳犫犈基因序列(参见附录A)设计的内、外引物及环状引物各一对,特异性1犛犖/犜2754.2—2011识别靶序列上的八个独立区域,利用犅狊狋酶启动循环链置换反应,在狉犳犫犈基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,加入显色液,即可通过颜色变化观察判定结果。7 试剂和材料除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1 引物:根据大肠杆菌O157属rfbE基因序列设计一套特异性引物,包括外引物1,外引物2和内引物1,内引物2及环状上游引物和环状下游引物。外引物扩增片段长度:239bp外引物1(F3,5’3’):GGTGGAATGGTTGTCACGA外引物2(B3,5’3’):TGGACTTGTACAAGACTGTTGA内引物1(FIP,5’3’):AACGTCATGCCAATATTGCCTATGTttttATGACAAAACACTTTATGACCGT内引物2(BIP,5’3’):GGATGACAAATATCTGCGCTGCTATttttTCAGCAATTTCACGTTTTCGTGATAT环状上游引物(LF,5’3’):CAGCTAATCCTTGGCCTTTAAAATG环状下游引物(LB,5’3’):TAGCCCAGTTAGAACAAGCTGAT7.2 犅狊狋DNA聚合酶。7.3 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。7.4 DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒。7.5 TE缓冲液:10mmol/LTrisHCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。7.6 ThermoPol缓冲液:200mmol/LTrisHCl、100mmol/L氯化钾、20mmol/L氯化镁、100mmol/L硫酸铵、1%TritonX100(pH8.8)。7.7 硫酸镁:50mmol/L。7.8 甜菜碱:5mol/L。7.9 显色液:SYBRGreenⅠ荧光染料,1000×。7.10 阳性对照:大肠杆菌O157标准菌株,或含目的片段的DNA亦可。7.11 1.5mL塑料离心管。8 仪器和设备8.1 移液器:量程0.5μL~10μL;量程10μL~100μL;量程100μL~1000μL。8.2 高速台式离心机:≥7000犵。8.3 水浴锅或加热模块:65℃±1℃和100℃±1℃。8.4 计时器。9 检测程序食品中大肠杆菌O157LAMP检测程序见图1。2犛犖/犜2754.2—2011图1 食品中大肠杆菌犗157犔犃犕犘检测程序10 操作步骤10.1 样品制备及增菌培养按照GB/T4789.6的方法进行样品制备和增菌。10.2 模板犇犖犃提取1)10.2.1 增菌液模板犇犖犃的制备1) 采用下述方法,也可使用等效的商品化的NDA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。 对于10.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板DNA:a) 直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中,7000犵离心2min,尽量吸弃上清液;b) 加入50μLTE,混匀后沸水浴10min,置冰上10min;c) 7000犵离心2min,上清液即为模板NDA;取上清液置-20℃可保存6个月备用。10.2.2 可疑菌落模板犇犖犃的制备对于10.1分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑菌落,再按照10.2.1b)步骤制备模板DNA以待检测。10.3 环介导恒温核酸扩增10.3.1 反应体系大肠杆菌O157LAMP反应体系见表1。3犛犖/犜2754.2—2011表1 大肠杆菌犗157犔犃犕犘反应体系组 分工作液浓度加样量μL反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10×5.01×外侧上游引物(F3)20μmol/L0.50.2μmol/L外侧下游引物(B3)20μmol/L0.50.2μmol/L内侧上游引物(FIP)20μmol/L2.00.8μmol/L内侧下游引物(BIP)20μmol/L2.00.8μmol/L环状上游引物(LF)20μmol/L1.00.4μmol/L环状下游引物(LB)20μmol/L1.00.4μmol/LdNTPs10mmol/L8.01.6mmol/L硫酸镁50mmol/L2.02.0mmol/L甜菜碱5mol/L8.00.8mol/L犅狊狋DNA聚合酶8U/μL10.16U/μLDNA模板—2—去离子水—17.0—10.3.2 反应过程10.3.2.1 按表1所述配制反应体系。10.3.2.2 65℃扩增60min。10.3.3 空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照设为以水替代DNA模板。阴性对照以TE缓冲液代替模板DNA。阳性对照制备:将大肠杆菌O157标准菌株接种于营养肉汤中36℃±1℃培养过夜,用无菌生理盐水稀释至约106CFU/mL~108CFU/mL(约麦氏浊度0.4),按10.2.1提取模板DNA作为LAMP反应的模板。10.4 结果观察在上述反应管中加入1μL显色液,轻轻混匀并在黑色背景下观察。10.5 结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色,阳性对照反应管液体呈绿色的条件下:a) 待检样品反应管液体呈绿色,该样品结果为大肠杆菌O157初筛阳性,对样品的增菌液或可疑纯菌落进一步按GB/T4789.6中操作步骤进行确认后报告结果;b) 待检样品反应管液体呈橙色则可报告大肠杆菌O157检验结果为阴性。若与上述条件不符,则本次检测结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。4犛犖/犜2754.2—2011附 录 犃(资料性附录)大肠杆菌犗157靶基因序列犃.1 大肠杆菌犗157靶基因序列(犪犮犮犲狊狊犻狅狀狀狅.犃犉163332.1)1 gttctaaata taaaggtaaa tatgtgggaa catttggaga tatttctact tttagctttt61 ttggaaataa aactattact acaggtgaag gtggaatggt tgtcacgaat gacaaaacac121 tttatgaccg ttgtttacat tttaaaggcc aaggattagc tgtacatagg caatattggc181 atgacgttat aggctacaat tataggatga caaatatctg cgctgctata ggattagccc241 agttagaaca agctgatcat tttatatcac gaaaacgtga aatcgctgat atttataaaa301 aaaatatcaa cagtcttgta caagtccaca aggaaagtaa agatgttttt cacacttatt361 ggatggtctc aattctaact aggaccgcag aggaaagaga ggaattaagg aatcaccttg421 cagataaact catcgaaaca aggccagttt tttacc注:阴影所示部分为大肠杆菌O157靶基因序列。犃.2 组成引物中碱基构成注:TTTT为连接序列。5犛犖/犜2754.2—2011
本文标题:SNT 2754.2-2011 出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法 第2部分大肠杆菌
链接地址:https://www.777doc.com/doc-8043728 .html