SNT 2021-2007 牛无浆体病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０２１—２００７牛无浆体病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犫狅狏犻狀犲犪狀犪狆犾犪狊犿狅狊犻狊２００７１２２４发布２００８０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书目!!次前言!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!范围!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!规范性引用文件!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!#!概述!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$!诊断技术!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%!!临床症状和病理变化!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%!病原鉴定!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%#!血清学检测&!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!附录’!资料性附录!牛无浆体病概述(!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!附录)!规范性附录!载玻片的处理和姬姆萨染色液的配制!!!!!!!!!!!!!!!!!!附录*!规范性附录!+*,试剂的配制!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!附录-!规范性附录!血清学试剂的配制!&!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!#!!#!$前!!言!!本标准是参照国际动物卫生组织!./0#12342567-82936:;8$=:;:23?@283:76A=AA:;A825’38B25:%!CC$版*D’+=0,%#%E).@/F0’F’+G’H1.H/H$结合国内外大量参考文献和标准起草单位进行的牛无浆体病诊断方法的研究成果编写的&本标准的附录)’附录*’附录-为规范性附录$附录’为资料性附录&本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口&本标准起草单位(中华人民共和国上海出入境检验检疫局’中国农业科学院上海兽医研究所’华中农业大学&本标准主要起草人(李树清’陈志飞’何国声’姚宝安’由轩’吴鉴三’王贵强’杜凯&本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准&!!!#!!#!$牛无浆体病检疫技术规范#!范围本标准规定了牛无浆体病的检疫技术规范$包括涂片镜检’聚合酶链式反应’酶联免疫吸附试验检测方法&本标准适用于牛无浆体病的检疫&!!规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款&凡是注日期的引用文件$其随后所有的修改单!不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准$然而$鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本&凡是不注日期的引用文件$其最新版本适用于本标准&I))=!JK&!!牛无浆体病快速凝集检测方法HF)=!KE(!动物边虫病微量补体结合试验操作规程%!概述牛无浆体病!)6L83232M52:B6:8:是由无浆体寄生于牛红细胞内$引起发热’贫血’黄疸和渐进性消瘦$甚至死亡的一种疾病&该病的分布’病原分类’传播媒介等参见附录’&牛无浆体病的诊断方法包括$临床症状和病理变化$病原鉴定及血清抗体检测&血清学检测方法中$补体结合试验!*6BM5B3;78N2;863;:;$*O=和卡片凝集试验!*2A?29954;832;863;:;$*’=是最常用的方法&*O=使用了很多年$操作规程见HF)=!KE($但最近的资料证实*O=在诊断持续感染牛时$敏感性仅CP$大部分的病原携带者不能被检测出&因此$*O=试验对单个动物的确证是不可靠的&*’=的优点是敏感’快速$既可在实验室也可以在田间进行$能在几分钟得出试验结果&假阴性率很低$但非特异反应是个问题&可作为初筛方法$操作程序见I))=!JK&!&竞争0G/H’方法在检测感染动物$其敏感性大大增加&间接0G/H’’斑点0G/H’和荧光抗体试验也可用于特异的抗体检测$但间接荧光抗体试验由于一名操作人员一天检测样品数量有限$而且有非特异性的荧光反应$通常都愿选用其他血清学检测方法&&!诊断技术&%#!临床症状和病理变化无浆体病随着动物年龄的增加而变得严重$感染牛表现为体温持续升高$达!C?#!?$但很少超过$!Q$并伴有贫血’虚弱和呼吸困难$特别是运动以后加剧&早期精神沉郁$食欲减退不明显$但随着病程的发展而逐渐明显&最典型的临床症状是贫血和黄疸$后者出现在疾病的后期&不会出现血红蛋白贫血和血红蛋白尿$但由于尿中出现胆色素$感染牛出现褐色尿$这一点有助于鉴别诊断无浆体病和巴贝斯虫病&这两个病经常在同一地区流行$只能通过病原鉴定进行确诊&另外$当血涂片中无浆体数量较少!如处于疾病的恢复阶段$红细胞数量和红细胞压积的降低有助于诊断无浆体的感染&边缘无浆体致病性强$爆发流行时牛的死亡率可达&CP#JCP&孕牛出现流产$良种奶牛的产奶量降低#CP#&CP$甚至停止泌乳&肉用牛体重也大量下降$使畜产品的质量和数量遭受严重损失&尸体解剖表现出贫血和消瘦$黄疸$肝’脾肿大$器官黄染$胆汁浓稠$有时心脏出血$尿液比正常暗&肝坏死也是本病的特征&中央无浆体致病性弱$牛感染后影响较小&!!!#!!#!$&%!!病原鉴定&%!%#!镜检鉴定病原&%!%#%#!血涂片的制备在洁净的载玻片!载玻片处理见第)%!章三分之一处蘸血一小滴$以一端缘光滑的载波片为推片$将推片的一端置于血滴之前$待血液沿推片端缘扩散后$自右向左推成薄血膜&理想的血膜中$红细胞呈均匀分布$空气干燥的血涂片可在室温保存至少!周&若血涂片不满意$可用抗凝血来制备&与牛巴贝斯虫不同$无浆体不积聚在毛细血管$因此$从颈静脉或其他大的血管采血较好&由于无浆体无特殊形态$要求血片质量要高$没有杂质$因碎片会引起误诊&厚的血涂片适宜诊断巴贝斯虫$不适宜无浆体$因为无浆体一旦与红细胞分离就很难鉴定&死亡动物应使用肝’肾’心’肺和外周血制备薄血片&脑涂片对牛巴贝斯虫的诊断是很有用的$对于无浆体无直接的诊断价值$但可以用于鉴别诊断&从组织收集血液用于制片比组织本身好$因显微镜下检查且标是完整红细胞中的无浆体&&%!%#%!!血涂片染色血液或组织涂片$用姬姆萨染色进行镜检是最常用的鉴定无浆体方法&血液或组织涂片先用无水甲醇固定!B83$用!CP姬姆萨!配制方法见第)%章染色#CB83&染色后涂片用自来水冲洗#次#$次$以除去附着的染料$但不要超过&:$否则样本会脱色$然后空气干燥&&%!%#%%!显微观察在显微镜下先以低倍镜!!CR!C观察血涂片$调节视野$然后以油镜!!CR!CC观察&无浆体是寄生在红细胞内的一种圆球形生物$只有一个染色质团$无细胞浆$故称无浆体&在姬姆萨染色的涂片中$无浆体在红细胞内为致密’圆形’深染的紫红色小体$直径约C%#$B#!%C$B&边缘无浆体大多数位于或接近红细胞的边缘!见图!$箭头所指的小圆点为边缘无浆体$大的为红细胞&这个特征可区分边缘无浆体和中央无浆体$后者大多数更接近红细胞的中央&红细胞感染的百分率因疾病的不同阶段和严重程度不同&边缘无浆体的最大感染率可以超过&CP&在严重的菌血症期$多个无浆体感染一个红细胞是很普遍的&感染后周#K周显微镜下可见菌体&在发病期间$红细胞染菌率几乎随天数成倍提高$持续大约!C?&然后$以同样的速度下降&血液涂片查不出菌体后$严重的贫血还会持续几周&初次感染康复后$大多数牛终身隐性感染&因此$涂片检测适用于急性感染期&图#!姬姆萨染色边缘无浆体!#’#油镜&%!%!!套式$%&检测鉴定病原&%!%!%#!原理无浆体主要的表面蛋白有六种$分别为1H+!%’1H+!&’1H+’1H+#’1H+$’1H+&&1H+$和1H+&高度保守&根据编码无浆体1H+$基因序列1H+$的保守区$设计了针对边缘无浆体!!#$%&!!#!!#!$’()$*+’中央无浆体!!,+)-%$*+和绵羊无浆体!!./(0三者通用的对引物’1.*()’1.*&和’1.*#)’1.*$$及分别针对三者的特异引物’1!)’1&’’*)’*$和’.!)’.K&以’1.*()’1.*&为套式+*,第一轮引物$以其他为第二轮引物$分别扩增出E!KSM’$#!SM’#!CSM’&J$SM的-F’片段$用于鉴定无浆体’边缘无浆体’中央无浆体和绵羊无浆体&套式+*,检测无浆体的最低-F’量为C%M9!相当于K个感染红细胞$可以检测出红细胞感染率为C%CCCCC!P的带菌牛&检测样品时$先用通用引物进行套式+*,反应$检测出阳性样品$然后以+*,第一轮产物为模板$用特异引物对阳性样品加以鉴别&&%!%!%!!设备和材料&%!%!%!%#!仪器设备***+*,扩增仪+***电泳仪+***凝胶成像系统+***微波炉+***可调移液器+***离心机+***天平+***水浴锅&&%!%!%!%!!耗材***+*,反应管+***!%&BG离心管+***移液器滴头&&%!%!%!%%!试剂***三蒸水C%!C#1+2灭菌!&B83+***琼脂糖+***皂素+***溴化乙锭+***1$2酶!&T)$G+***!CR+*,反应缓冲液+***氯化镁!19*5&BB65)G+***!BB65)G?F=++***酚U三氯甲烷U异戊醇!&V$V!+***分子量指示物!!CCSM#CCCSM-F’12AWA+***除另有规定$所用化学试剂均为分析纯&&%!%!%!%&!溶液的配制#%JP柠檬酸钠’!%&P乙二胺四乙酸二钠!0-=’二钠’’5:LA,:液’=F0’,F’酶’’!CPH-H’CB9)BG蛋白酶X’ECP乙醇’!CB9)BG溴化乙锭!0)’!%&P琼脂糖凝胶’KR加样缓冲液的配制见附录*&&%!%!%%!引物引物序列见表!&引物用灭菌三蒸水配成!CC$B65)G母液$YCQ冻存&使用时用灭菌三蒸水配成&$B65)G的工作液&#!!#!!#!$表#!试验所用引物序列引!!物核苷酸序列位!!置产物大小)SM’1.*(2&ZUI*=***=’*==I==’I=IIU#Z&KUE$’1.*&S&ZU==’I*=I’’*’II’’=*==IU#ZJ#CUJ$(’1.*#2&ZU*I=’I=II*’=*=***’=IU#ZEJU(E’1.*$S&ZU’*=I’II*====I*==*=**U#ZEEUE(#’1!2&ZUII’I**’I’I=II’’==IU#Z#&JU#EE’1&S&ZUI’II*====I*==*=**’I’U#ZEK(UEJJ’.!2&ZU*’’I*’I’I’I’**=*I=’=U#ZCKUK?’.KS&ZUII*====I*==*=**IIIU#ZEEUEJ(?’*2&ZU’’I’I’*==**=’*I=*’’IU#Z!EU!$E’*$S&ZUI=I===’=’’===*I=**’**U#Z$!KU$#KE!K$#!&J$#!C!!2上游引物76A[2A?MA8BA&!!S下游引物ALA:MA8BA&!!F456;8?562;86383’\EJK((#&!!?F456;8?562;86383’\EC($&!!F456;8?562;86383’\C&$#J#&&%!%!%&!样品采集无菌采牛血$用#%JP柠檬酸钠或!%&P0-=’二钠抗凝作为临床检测样品&&%!%!%(!样品处理采集的血液!BG与等体积的’5:LA,:混合$$Q$&CCR’离心CB83$去上清液&以相同的条件用’5:LA,:液洗&次&压积细胞#EQ预温!CB83$加入等体积#EQ预温的含皂素’5:LA,:液$#EQ孵育B83$加!%BG预冷的=F0$混匀&$Q$&CCR’离心!&B83去沉淀&$Q$ECCCR’离心CB83去上清液&沉淀溶于ECC$G=F0中$加!CPH-H#&$G和!CB9)BG,F’酶’E$G$#EQ作用!]#]&然后加CB9)BG蛋白酶X$