SNT 1447-2011 猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４４７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４，ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪狅犳狊狑犻狀犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１４４７—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张１．５　字数４１千字２０１１年１２月第一版　２０１１年１２月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６１１　定价２４．００元书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４《猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验》、ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５《猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４和ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５相比，主要技术变化如下：———增加了细菌分离鉴定；———补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王巧全、李树清、张强、李健、胡永强、刘俊平、熊炜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４；———ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５。Ⅰ犛犖／犜１４４７—２０１１猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范１　范围本标准规定了猪传染性胸膜肺炎的细菌分离鉴定、聚合酶链式反应、补体结合试验、阻断酶联免疫吸附试验等实验室检测的操作程序及技术要求。本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫、诊断、流行病学调查和免疫监测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样。３　疾病简介参见附录Ａ。４　现场检疫及采样４．１　现场检疫逐头进行临床检查，根据动物病情、临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。４．２　采样４．２．１　病料的采集标准按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定采样。４．２．２　活体病料采集用棉拭子采鼻腔分泌物，放入无菌试管中送实验室进行检验。４．２．３　组织样品的采集无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、扁桃体。４．２．４　血样的采集制备无菌操作采集动物血，每头不少于１０ｍＬ。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。５　实验室诊断５．１　总则对该病可以进行细菌分离鉴定、分子生物学或血清学检查等。１犛犖／犜１４４７—２０１１其中细菌分离、聚合酶链式反应主要检病原，补体结合试验、酶联免疫吸附试验主要检抗体。５．２　细菌分离鉴定５．２．１　试剂营养琼脂、血琼脂、巧克力琼脂、类胸膜肺炎微生物（ＰＰＬＯ）琼脂。５．２．２　病原分离将样品按常规分离要求直接接种到血琼脂表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线于３７℃含５％二氧化碳（ＣＯ２）下培养。继代培养用巧克力琼脂和ＰＰＬＯ琼脂进行培养。５．２．３　病原鉴定培养形态及染色特性：于血琼脂平板培养２４ｈ～４８ｈ，胸膜肺炎放线杆菌（ＡＰＰ）为露珠样的小菌落，直径１ｍｍ～２ｍｍ。多数菌株产生β溶血带，靠近鸡表皮葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线的距离增加而变小或不生长，即所谓“卫星现象”。取典型菌落作革兰氏染色，应为革兰氏阴性小球杆菌，两极着色继代培养中呈明显多形态，幼龄培养物中偶有成丝状。５．２．４　判定被分离菌具有以下特点即可初步判定为猪胸膜肺炎放线杆菌：———染色镜检为革兰氏阴性杆菌或多形态；———在血琼脂培养基上生长具有溶血现象；———生长培养需要ｖ因子，即具有“卫星现象”；———被检菌生化特性：尿素酶试验为阳性，能分解Ｄ木糖、甘露醇，不分解棉子糖、阿拉伯胶糖。５．３　猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应５．３．１　设备和材料５．３．１．１　仪器设备５．３．１．１．１　ＰＣＲ扩增仪。５．３．１．１．２　电泳仪。５．３．１．１．３　凝胶成像系统。５．３．１．２　试剂５．３．１．２．１　三蒸水０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ。５．３．１．２．２　吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ。５．３．１．２．３　琼脂糖。５．３．１．２．４　溴化乙锭。５．３．１．２．５　犜犪狇酶。５．３．１．２．６　２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。５．３．１．２．７　２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。５．３．１．２．８　分子量指示物：１００ｂｐ～２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ。２犛犖／犜１４４７—２０１１５．３．１．２．９　ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ乙酸电泳缓冲液（ＴＡＥ）、琼脂糖凝胶、６×加样缓冲液（见Ｂ．６）、１０×ＰＣＲ缓冲液（见Ｂ．７）。５．３．１．３　引物引物见表１。表１　引物引　　物核苷酸序列引物浓度μｍｏｌ／Ｌ产物大小ｂｐＳ７ａ５’ｃｔｔｔａｇｇｇａｇｇｇｇｔａｇａａｔｔ３’５Ｓ１０ｂ５’ｇａｔｔａｃｔａｇｃｇａｔｔｃｃｇａｃｔｔ３’５６９２Ｐ１ａ５’ｃｇｔａａｃｔｃｇｇｔｇａｔｔｇａｔｇｃ３’５Ｐ４ｂ５’ｃｇｔｔｔｇｃｔｃａｔｔｃｇａｔａａａｃｇ３’５３６３Ｐ６ａ５’ｇｔｇｃｇｇｇｔａａｔｇａｔａｃｇｇｔｔ３’５Ｐ８ｂ５’ｃｇｇｃｔａａａｃｃａａａｇｔｔｃｇｇａｔ３’５２２３　　ａ上游引物ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ。　　ｂ下游引物ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ。５．３．２　操作步骤５．３．２．１　样品被检菌株、扁桃体、肺等组织样品及鼻拭子。５．３．２．２　样品处理菌株：挑取可疑菌落于ｐＨ７．２０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ中，制成约１０８菌悬液（液体稍浑浊），再用ＰＢＳ进行１０倍、１００倍稀释。原液、１０倍和１００倍稀释液均作为复合ＰＣＲ扩增的模板。组织样品及鼻拭子：取组织０．５ｇ～１ｇ剪碎，加入１ｍＬＰＢＳ缓冲液，匀浆。鼻拭子在１ｍＬＰＢＳ缓冲液中反复挤压。分别将挤下的液体和组织匀浆液１００犵离心５ｍｉｎ，弃沉淀。上清液１００００犵离心５ｍｉｎ，弃上清液。沉淀加入５０μＬＰＢＳ和１μＬ灭菌吐温２０，－２０℃冷冻１５ｍｉｎ，取出立即置１００℃水浴中煮沸５ｍｉｎ，重复冻融、煮沸两次。１００００犵离心５ｍｉｎ，留上清液，取部分上清液进行１０倍、１００倍稀释。原液、１０倍和１００倍稀释液均作为套式ＰＣＲ扩增的模板。ＡＰＰ阳性和阴性组织进行同样的处理。５．３．２．３　复合犘犆犚５．３．２．３．１　对照设立阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株ＤＮＡ。阴性对照用林氏放线杆菌（犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊犾犻犵狀犻犲狉犲狊犻犻）菌株ＤＮＡ。空白对照用等体积的水代替模板。ＡＰＰ菌株的培养（方法见Ｃ．２）。ＤＮＡ的提取（方法见Ｄ．２）。３犛犖／犜１４４７—２０１１５．３．２．３．２　犘犆犚反应体系总体积３０μＬ，１０×ＰＣＲ反应缓冲液３μＬ；氯化镁３μＬ；ｄＮＴＰ３μＬ；引物Ｓ７和Ｓ１０各０．５μＬ；Ｐ１和Ｐ４各０．７５μＬ；１μＬ模板，阳性和阴性对照１０ｎｇ～２０ｎｇＤＮＡ；１单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，并加入１％灭菌吐温２０，补充水至３０μＬ。５．３．２．３．３　循环参数ＰＣＲ反应为９６℃６ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ。５．３．２．３．４　电泳取产物１０μＬ与２μＬ６×加样缓冲液混合，加样于含ＥＢ的１．５％琼脂糖凝胶中。在１×ＴＡＥ缓冲液中，３Ｖ／ｃｍ～４Ｖ／ｃｍ电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。阳性、阴性、空白对照和ＤＮＡ相对分子质量指示物同样电泳。５．３．２．４　套式犘犆犚５．３．２．４．１　对照设立阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株ＤＮＡ，或已知ＡＰＰ阳性组织制备的模板。阴性对照用林氏放线杆菌菌株ＤＮＡ，或已知ＡＰＰ阴性组织制备的模板。空白对照用等体积的水代替模板。５．３．２．４．２　反应体系总体积３０μＬ，１０×ＰＣＲ反应缓冲液３μＬ；氯化镁３μＬ；ｄＮＴＰ３μＬ；每轮相应引物各０．５μＬ；１μＬ模板，阳性和阴性ＤＮＡ对照１０ｐｇ～２０ｐｇＤＮＡ；第一轮用１单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，并加入１％灭菌吐温２０。第二轮用０．５单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶；补充水至３０μＬ。５．３．２．４．３　循环参数第一轮ＰＣＲ使用引物Ｐ１／Ｐ４，９６℃６ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，２５个循环；７２℃５ｍｉｎ。取第一轮ＰＣＲ反应产物１μＬ，用引物Ｐ６／Ｐ８进行第二轮ＰＣＲ扩增，９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３５个循环；７２℃３ｍｉｎ。５．３．２．４．４　电泳按５．３．２．３．４操作。５．３．３　结果判定５．３．３．１　复合犘犆犚阳性对照会出现６９２ｂｐ和３６３ｂｐ的ＤＮＡ片段。阴性对照会出现６９２ｂｐ的ＤＮＡ片段，但不出现３６３ｂｐ的ＤＮＡ片段。空白对照在６９２ｂｐ和３６３ｂｐ均没有核酸带。对照成立才能进行判定。菌株原液、１０倍和１００倍稀释菌悬液经复合ＰＣＲ扩增后：在６９２ｂｐ和３６３ｂｐＤＮＡ位置上都有核４犛犖／犜１４４７—２０１１酸带，判为阳性菌株。阳性菌株ＰＣＲ产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在３６３ｂｐＤＮＡ位置上判为阴性菌株。５．３．３．２　套式犘犆犚阳性对照会出现２２３ｂｐ特异的ＤＮＡ片段。阴性和空白对照均没有该核酸带。对照成立才能进行判定。待测样品原液、１０倍和１００倍稀释液经套式ＰＣＲ扩增后：在２２３ｂｐＤＮＡ位置上有核酸带，判为阳性样品。阳性样品ＰＣＲ产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在２２３ｂｐＤＮＡ位置上，判为阴性样品。５．４　补体结合试验５．４．１　材料准备５．４．１．１　巴比妥缓冲液（犞犅犇）配制方法见附录Ｅ。５．４．１．２　标准抗原和血清标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清需添加到补体中的标准犊牛血清。５．４．１．３　溶血素效价滴定先将溶血素用ＶＢＤ作１∶１００稀释（取０．２ｍＬ含等量甘油的溶血素，加９．８ｍＬＶＢＤ），按表２制备６管不同稀释倍数溶血素。表２　稀释溶血素单位为毫升试管号１２３４５６稀释倍数１０００×２０００×２５００×３０００×４０００×８０００×ＶＢＤ９．０１．０１．５２．０３．０７．０１∶１００溶血素１．０１∶１０００溶血素１．０１．０１．０１．０１．０取６支试管，分别标上６个溶血素浓度，每管各加１．０ｍＬ标准红细胞悬液（见附录Ｆ），再加上不同稀释倍数的溶血素１．０ｍＬ到相应的试管中，３７℃水浴１５ｍｉｎ，即成致敏红细胞。用冷至４℃的ＶＢＤ液将补体作１∶４００稀释，放４℃冰箱于２ｈ内使用。取６支试管，分别标上各溶血素稀释度，每管加ＶＢＤ０．４ｍＬ，１∶４００补体０．４ｍＬ（根据补体效价高低，可用大于或小于１∶４００的稀释度），再在各管内加入不同稀释度溶血素致敏红细胞悬液０．２ｍＬ。混匀后置３７℃水浴１ｈ，取出后以１０００犵离心５ｍｉｎ，与标准溶血管（见附录Ｇ）比较，求得各管溶血度的百分率。以各管溶血度的百分率为纵坐标，稀释倍数为横坐标（以１∶１０００稀释度的适当长度为１，１∶２０００为１／２，１∶２５００为２／５，１∶３０００为１／３，１∶４０００为１／４，１∶８０００为１／８。）画图。合适的溶血素效价为平稳区的第二个稀释度。５犛犖／犜１４４７—２０１１５．４．１．４　补体效价滴定５．４．１．４．１　取４支试管，按表３加入试剂，混匀，３７℃水浴３０ｍｉｎ，期间摇匀一次。表３　补体效价滴定单位为毫升试　　剂管　　号１２３４ＶＢＤ０．６０．５５０．５０．４１∶４００稀释补体０．２０．２５０．３０．４致敏红细胞０．２