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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖/犜1128—2007代替SN/T1128—2002赤羽病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犪犽犪犫犪狀犲20071224发布20080701实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准代替SN/T1128—2002《赤羽病毒微量血清中和试验操作规程》。本标准与SN/T1128—2002相比主要变化如下:———将2002版的种毒繁殖和毒价测定纳入附录B;———将2002版的试验程序的文字表述和阳性对照、病毒回归的稀释度作了修改;———将2002版的结果判定有关对照的表述进行细化。本标准的附录B和附录C为规范性附录,附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局和中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:许如苏、刘中勇、董志珍、杨元杰、马保华、吴松浩、陈茹。本标准所代替标准的历次发布版本为:———SN/T1128—2002。Ⅰ犛犖/犜1128—2007赤羽病检疫技术规范1 范围本标准规定了赤羽病的检疫技术规范,包括病毒分离鉴定、微量血清中和试验、阻断酶联免疫吸附试验和琼脂免疫扩散试验。本标准适用于进出口牛、羊赤羽病的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—1992,neqISO3696:1987)GB19489 实验室 生物安全通用要求3 生物安全措施赤羽病相关资料参见附录A。试验环境和防护要求见GB19489。4 缩略语下列缩略语适用于本标准。4.1 犃犓犃犞 犪犽犪犫犪狀犲狏犻狉狌狊赤羽病毒。4.2 犅犎犓21 犫犪犫狔犺犪犿狊狋犲狉犽犻犱狀犲狔幼仓鼠肾细胞。4.3 犆犉犈 犮狔狋狅狆犪狋犺犻犮犲犳犳犲犮狋细胞病变。4.4 犎犿犾狌1 犺犪犿狊狋犲狉犾狌狀犵犮犲犾犾仓鼠肺细胞。4.5 犉犐犜犆 犳犾狌狅狉犲狊犮犲犻狀犻狊狅狋犺犻狅犮狔犪狀犪狋犲异硫氰酸荧光素。4.6 犞犲狉狅非洲绿猴肾细胞。1犛犖/犜1128—20075 病毒的分离鉴定5.1 试剂与材料5.1.1 AKAV。5.1.2 AKAV阳性血清和阴性血清:试验前血清需经56℃灭活30min。5.1.3 兔抗AKAV抗体:使用时用PBS稀释至工作浓度。5.1.4 FITC标记的羊抗兔IgG:使用时用含0.01%伊文思蓝的样品稀释液稀释至工作浓度。5.1.5 Vero细胞、BHK21细胞或Hmlu1细胞:使用时配制成3×105/mL细胞悬液。5.1.6 1日~2日龄乳鼠。5.1.7 6日~8日龄SPF鸡胚。5.1.8 病料:无菌采取流产胎儿或死胎的脑、脊髓、胎盘、肝、脾、肺、肾等器官组织。冷冻保存。5.1.9 溶液配制:包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS等。配方及配制方法见附录B。5.2 设备 5.2.1 倒置光学显微镜、荧光显微镜。5.2.2 二氧化碳培养箱。5.2.3 研钵或组织捣碎机、离心机。5.2.4 血球计数板。5.2.5 可调微量移液器(20μL~200μL,100μL~1000μL)。5.2.6 细胞培养瓶(5mL)、细胞培养板等。5.3 组织悬液制备 将病料剪碎,置研钵或组织捣碎机中研磨或捣碎,用加双抗(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL)的细胞培养液或PBS制成10%的组织悬液,于4℃浸泡4h,然后反复冻融3次。以3000r/min离心20min,取上清液保存备用。5.4 病毒分离5.4.1 细胞分离法按常规方法培养细胞单层,待长至80%左右,吸去培养液,用无血清培养液洗涤1次。如用细胞培养瓶,则按1mL/25cm2接种组织上清液,每样接种2瓶。如用细胞培养板,则按每孔0.1mL接种组织上清液,每样接种2孔。置37℃5%二氧化碳培养箱内培养。于37℃吸附1h后吸去上清液,加细胞维持液,置37℃5%二氧化碳培养箱内培养,24h后逐日观察CPE,连续观察7d。无CPE的盲传2代。如有CPE,则待70%细胞出现CPE时收毒,将细胞冻融2次,3000r/min离心20min,取上清液保存待鉴定。5.4.2 乳鼠分离法取1d~2d龄健康乳鼠,每只脑内接种组织上清液0.01mL,每样接种5只,每天至少观察三次,连续观察7d,及时收集濒死和发病乳鼠的脑组织。按5.3方法制成上清液供传代或鉴定。接种第1代乳鼠未出现发病死亡的,宜用乳鼠传代2次或再接种细胞或鸡胚进一步分离。5.4.3 鸡胚分离法用组织上清液接种6日~8日龄SPF鸡胚卵黄囊,每样接种4枚,每枚接种0.1mL。每天早晚照蛋1次,连续7d,弃去24h内非特异性死亡鸡胚。收获死胚和未死亡鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊液、脑、肝、脾、肾、肌肉组织等,有病变的以收获病变组织为佳。按5.3方法制成上清液,供传代或鉴定。接种第1代未出现死胚的,宜盲传2代。5.5 分离毒鉴定5.5.1 微量病毒中和试验5.5.1.1 分离毒血清中和取细胞培养板,每孔加入细胞培养液225μL。于第1孔内加入分离毒25μL,充分混匀后,取25μL2犛犖/犜1128—2007加入第2孔,依次将分离毒作10倍连续稀释至10-6,最后1孔弃去25μL,共稀释2排。在第1排内加入等量(225μL)的1∶10阳性血清,在第2排内加入等量(225μL)的阴性血清。混匀后室温作用1h。另取1块细胞培养板,将第1排的各稀释度分离毒阳性血清混合液分别加入1排~4排内,每个稀释度加4孔,每孔100μL;同样地,将第2排的各稀释度分离毒阴性血清混合液分别加入5排~8排内。于分离毒血清混合液各孔内分别加入细胞悬液,每孔100μL。置37℃5%二氧化碳培养箱内培养。24h后开始逐日观察CPE,连续观察5d。按Karber法计算TCID50(见附录C)。5.5.1.2 设立对照———病毒对照。用AKAV代替分离毒按5.5.1.1操作。———细胞对照。4孔,每孔100μL细胞培养液+100μL细胞悬液。———血清毒性对照。阴、阳性血清毒性对照各4孔,每孔50μL血清+50μL细胞培养液+100μL细胞液。5.5.1.3 结果判定细胞对照孔,血清毒性对照孔内细胞生长良好,无CPE;病毒阳性血清组和阴性血清组的TCID50对数之差大于等于3,试验成立,可进行结果判定。分离毒阳性血清组和阴性血清组的TCID50对数之差大于等于2.5的,判为AKAV阳性;分离毒阳性血清组和阴性血清组的TCID50对数之差小于2.5的,判为AKAV阴性。5.5.2 间接免疫荧光抗体试验5.5.2.1 培养细胞单层 将BHK21细胞、Vero细胞或Hmlu1细胞接种细胞培养板,每孔1mL。置37℃5%二氧化碳培养箱内培养。5.5.2.2 接毒待细胞长至80%单层时,吸去培养液,用PBS洗2次,接种分离毒,每样接2孔,每孔200μL(毒价为2×104TCID50/mL)。同时设病毒对照和不接毒细胞对照。37℃作用1h后加细胞维持液,置37℃5%二氧化碳培养箱内培养14h。5.5.2.3 加抗体染色吸去孔内维持液,待自然干燥后,用冷的无水乙醇4℃固定30min,用PBS洗涤3次,每次5min。每孔加入工作浓度的兔抗AKAV抗体200μL,37℃作用30min,取出用PBS洗涤3次,每孔加入工作浓度的FITC标记的羊抗兔IgG200μL,37℃作用30min,取出用PBS洗涤3次,吹干后立即用荧光显微镜观察。5.5.2.4 结果判定病毒对照孔的单个或成团细胞的胞浆内出现强绿色荧光信号,不接毒细胞对照无绿色荧光信号,则试验成立,可进行结果判定。分离毒孔内的单个或成团细胞的胞浆内出现绿色荧光信号的,判为阳性。分离毒孔内的单个或成团细胞的胞浆内无绿色荧光信号的,判为阴性。6 微量血清中和试验6.1 试剂与材料6.1.1 细胞采用BHK21细胞、Vero细胞或Hmlu1细胞。使用时配制成3×105/mL的细胞悬液。6.1.2 犃犓犃犞使用前测定病毒的毒价,具体操作见第C.2章。使用时用细胞培养液将病毒稀释成100TCID50/50μL的工作液。3犛犖/犜1128—20076.1.3 犃犓犃犞阳性血清和阴性血清使用前需经56℃,灭活30min。6.1.4 被检血清在无菌条件下采取血样,分离血清。使用前经56℃,灭活30min。6.1.5 试验溶液包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液等。配方及配制方法见附录B。6.2 设备6.2.1 倒置光学显微镜。6.2.2 二氧化碳培养箱。6.2.3 冰箱:-20℃保存血清,-70℃保存种毒。6.2.4 微量移液器(20μL~200μL)。6.2.5 细胞培养板等。6.3 试验程序6.3.1 被检血清病毒中和将被检血清作1∶4稀释(定性检测),或从1∶4稀释至1∶64或更高滴度(定量检测),每个稀释度加2孔,每孔加稀释血清和病毒工作液各50μL,混匀。37℃作用1h后,每孔均加入细胞悬液100μL。6.3.2 设立对照———正常细胞对照:2孔,每孔加细胞培养液100μL;———阳性血清对照:将阳性血清从1∶4开始2倍稀释至高于标定效价的2个滴度(例如标定效价为1∶64,则需稀释至1∶256),每个稀释度加2孔,每孔分别加已稀释阳性血清和病毒工作液各50μL,混匀;———阴性血清对照:2孔,每孔加阴性血清和病毒工作液各50μL,混匀;———病毒回归:将病毒工作液作10倍递增稀释至10-3,使病毒含量分别为100、10、1、0.1TCID50/50μL,每个稀释度加4孔,每孔加稀释病毒液和细胞培养液各50μL,混匀;———血清毒性对照:每份血清按稀释度各设1孔毒性对照,每孔加各稀释度血清和细胞培养液各50μL,混匀;———将上述各对照置37℃,1h后,每孔均加入细胞悬液100μL。6.3.3 培养将加完细胞悬液的细胞培养板置于5%二氧化碳培养箱中,37℃培养5d,24h后逐日在倒置光学显微镜下观察CPE并记录。6.4 结果判定 正常细胞对照孔细胞生长正常,无CPE,血清毒性对照孔不出现CPE,阴性血清对照孔出现CPE,阳性血清中和抗体滴度位于标定滴度±1个滴度范围内,病毒实际用量在30TCID50/50μL~300TCID50/50μL范围内,试验成立,可进行结果判定。判定时间为48h~120h。1孔以上(含1孔)被检血清孔不出现CPE的最高稀释度即为被检血清的中和抗体滴度。中和抗体滴度大于等于1∶4的被检血清判为阳性;中和抗体滴度小于1∶4的被检血清判为阴性。7 阻断酶联免疫吸附试验7.1 试剂与材料7.1.1 包被用AKAV抗原或已包被AKAV抗原的96孔酶标板。7.1.2 AKAV强阳性血清和弱阳性血清:使用前稀释至工作浓度。7.1.3 AKAV阴性血清。4犛犖/犜1128—20077.1.4 鼠抗AKAV单克隆抗体:使用前用样品稀释液(含1%水解酪蛋白的0.5mol/LNaCl溶液)稀释至工作浓度。7.1.5 辣根过氧化酶标记羊抗鼠IgG:使用前用酶标抗体稀释/阻断液稀释至工作浓度。7.1.6 被检血清:在无菌条件下采取血样,分离血清。试验前用样品稀释液作1∶10稀释。7.1.7 试验溶液试验溶液包括抗原包被液、洗涤液、样品稀释液、酶标抗体稀释/阻断液、底物溶液和终止液。配制方法见附录B。7.2 设备7.2.1 酶标仪。7.2.2 恒温培养箱。7.2.3 微量移液器(20μL~200μL)。7.2.4 96孔酶标板。7.3 操作步骤7.3.1 包被用抗原包被液将抗原稀释至工作浓度后,加入酶标板孔内,每孔50μL。将酶标板置于湿盒内于室温(20℃~25℃)下过夜。7.3.2 洗板弃去孔内
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