SNT 2744-2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!##!$%$鸭病毒性肠炎检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’1%.23*’%4+()+’*)*4!$%$5%%5$%发布!$%%5$&5$%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）中２．３．７章关于鸭病毒性肠炎的有关内容而制定：———修改采用了ＯＩＥ发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中病毒分离鉴定、ＰＣＲ方法、微量血清中和试验的技术要求；———增加了ＯＩＥ发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中没有提及的荧光ＰＣＲ检测方法、直接荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孟日增、石建平、王建华、肖成蕊、王伟利、王振国、刘晶。Ⅰ犛犖／犜２７４４—２０１０鸭病毒性肠炎检疫技术规范１　范围本标准规定了鸭病毒性肠炎的病毒分离与鉴定、ＰＣＲ方法、荧光定量ＰＣＲ方法、免疫荧光试验、微量中和试验、ＥＬＩＳＡ等操作规程及技术要求。本标准适用于鸭、鹅等水禽及天鹅（雁形目）鸭病毒性肠炎的诊断与检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　概述鸭病毒性肠炎（ｄｕｃｋｖｉｒｕｓｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）又称鸭瘟（ｄｕｃｋｐｌａｇｕｅ），该病是由疱疹病毒科鸭瘟病毒引起的一种急性（有时呈慢性）鸭、鹅和天鹅（雁形目）接触性传染病，其特征为体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪和部分病鸭头颈肿大。食道粘膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔粘膜充血出血水肿和假膜覆盖。肝有不规则大小不等的出血点和坏死灶。本病传播迅速，发病率和病死率都很高，严重地威胁养鸭业的发展。鸭病毒性肠炎的诊断方法包括临床综合诊断、病原学诊断、血清学试验和分子生物学检测。４　诊断技术４．１　临床综合诊断４．１．１　临床症状自然感染的潜伏期一般为３ｄ～４ｄ，鸭群突然出现持续性高死亡率，病初体温升高（４３℃以上），呈稽留热。这时病鸭表现精神萎顿，头颈缩起，食欲减少或停食，渴欲增加，羽毛松乱无光泽，两翅下垂，两脚麻痹无力、走动困难，流泪和眼睑水肿是鸭瘟的一个特征性症状。同时病鸭下痢，排出绿色或灰白色稀粪，泄殖腔粘膜充血，出血水肿严重者粘膜外翻。用手翻开肛门时，可见到泄殖腔粘膜有黄绿色的假膜，不易剥离。成年鸭死亡时膘情良好，死亡的鸭阴茎脱垂明显；产蛋鸭群在死亡高峰期产蛋明显下降；２周龄～７周龄商品雏鸭表现脱水、消瘦，喙发蓝，结膜炎、流泪、鼻腔有渗出物和泄殖腔有血染等特点。自然条件下鹅感染鸭瘟，其临床特点与鸭相似。４．１．２　病理学检查鸭瘟眼观变化见败血症的病变，体表皮肤有许多散在出血斑，眼睑常粘连分泌干酪样物覆盖。部分头颈肿胀的病例，皮下组织有黄色胶样浸润。食道粘膜有纵行排列的灰黄色假膜覆盖或小出血斑点，假膜易剥离，剥离后食道粘膜留有溃疡斑痕，这种病变具有特征性。肠粘膜充血出血，以十二指肠和直肠１犛犖／犜２７４４—２０１０最为严重。泄殖腔粘膜表面覆盖有一层灰褐色或绿色的坏死结痂，不易剥离，粘膜上有出血点和水肿。产蛋母鸭的卵巢滤泡增大，有出血点和出血斑，有时卵泡破裂，引起腹膜炎。雏鸭感染鸭瘟病毒时，法氏囊呈深红色，表面有针尖状的坏死灶，囊腔充满白色的凝固性渗出物，这些病变具有诊断意义。组织学变化，以血管壁损伤为主，小静脉和微血管明显受损，管壁内皮破裂。具有特征性组织学变化，见坏死的肝细胞发生明显肿胀和脂肪变性，肝索结构破坏，中央静脉红细胞崩解，血管周围有凝固性坏死。肝细胞见有核内包涵体。脾窦充满红细胞，血管周围有凝固性坏死。食道和泄殖腔粘膜上皮细胞坏死脱落，粘膜下层疏松，水肿，有淋巴样细胞浸润。胃肠粘膜上皮见有核内包涵体。结合临床症状与病理学检查，可对本病作出初步诊断。４．２　病毒分离与鉴定４．２．１　材料和试剂４．２．１．１　器材细胞培养瓶（或培养板）、吸管、移液器、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、Ｇ６玻璃滤器、孔径０．２２μｍ微孔滤膜。４．２．１．２　水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水要求。４．２．１．３　试剂胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液分别见附录Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。４．２．１．４　实验动物１日龄易感雏鸭、１０日龄～１４日龄ＳＰＦ鸭胚。４．２．１．５　细胞原代鸭胚成纤维细胞（ＤＥＦ细胞）、原代鸭胚肾细胞（ＤＥＫ）。４．２．２　病毒分离培养４．２．２．１　样品采集和运送４．２．２．１．１　样品采集在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，无菌采取肝、脾、肾组织样品。４．２．２．１．２　运送及保存条件立即进行实验室检测的样品，保存于４℃或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于－７０℃以下条件冷冻保存待检。４．２．２．２　样品制备血液样品应分离出血清或血浆，作为接种材料。组织样品（肝、脾、肾），加入无血清细胞培养液，制成１０％悬液，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液，加入１％双抗溶液，４℃作用３ｈ～４ｈ（样品确定未污染可不加双抗溶液处理）后备用。污染较为严２犛犖／犜２７４４—２０１０重的样品或可疑受污染的样品，应用０．２２μｍ的微孔滤膜进行过滤处理后作为接种材料。４．２．２．３　病毒分离方法４．２．２．３．１　接种实验动物法选取１日龄易感雏鸭１６只，分成两组。一组用４．２．２．２中制备的接种材料进行肌肉接种，每只０．５ｍＬ，另一组用同一剂量的无血清细胞培养液，隔离饲养作对照组。接种后逐日观察，连续观察３ｄ～１２ｄ。若对照组与接种组均无异常表现，可判定为病毒分离阴性；若对照组正常，接种组出现４．１．１中临床表现或死亡病例，立即进行剖检检查，剖检可见４．１．１与４．１．２中的病变，可收集病料进行病毒鉴定。４．２．２．３．２　细胞培养法按照常规方法制备ＤＥＦ单层细胞（可参照附录Ｂ．１），将制备好的样品接种于２４孔细胞培养板培养的原代细胞单层，每份样本至少接种４孔，每孔０．１ｍＬ～０．２ｍＬ，３７℃吸附１ｈ，倾去多余液体，加入１ｍＬ营养液，放入３７℃的５％二氧化碳恒温培养箱中培养３ｄ～５ｄ。设正常细胞对照至少４孔。样品接种２４ｈ后，于倒置显微镜下逐日观察细胞病变并作好相应记录，若细胞对照孔正常，而接种样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融３次后转入新长满单层的细胞培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定；若未出现细胞病变，则按未分离到鸭瘟病毒出具结果。４．２．２．３．３　鸭胚分离法将４．２．２．２中处理好的待接种样品无菌接种于至少１０枚９日龄～１４日龄种鸭胚的绒毛尿囊膜上，以后在暗室内逐日照胚观察鸭胚死亡情况并记录，弃去２４ｈ内死亡鸭胚，检查１０ｄ内死亡的鸭胚，若呈现特征性的弥漫性出血，收集绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）待鉴定。若胚体未死亡或死亡胚体无明显病变，则将ＣＡＭ悬液盲传两代，继续观察胚体死亡及病变情况，并收集ＣＡＭ及尿囊液进行病毒鉴定。４．２．３　病毒鉴定用ＰＣＲ方法（见４．３）、荧光定量ＰＣＲ方法（见４．４）和直接荧光抗体试验（见４．５）进行病毒鉴定。进行病毒分离与鉴定时，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。４．３　犘犆犚方法４．３．１　试剂与材料４．３．１．１　参考毒株：ＤＰＶＦ３４株，由指定单位提供。４．３．１．２　ｒ犜犪狇酶：５Ｕ／μＬ，保存于－２０℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。４．３．１．３　１０倍ＰＣＲ缓冲液：Ｍｇ２＋浓度２５ｍｍｏｌ／Ｌ。４．３．１．４　２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合液：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ四种脱氧核苷酸。４．３．１．５　蛋白酶Ｋ：浓度为１０ｍｇ／ｍＬ。４．３．１．６　引物：本试验选用保守性和特异性均好的指导ＤＮＡ聚合酶合成的基因（ＵＬ３１区）序列作为ＰＣＲ扩增区，设计两条引物Ｐ１、Ｐ２。引物位置和序列如下：Ｐ１（３７５８０～３７５９９）５’ＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡ３’Ｐ２（３７１５４～３７１７３）５’ＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧ３’３犛犖／犜２７４４—２０１０Ｐ１、Ｐ２引物扩增片段为４４６ｂｐ。４．３．２　其他试剂Ｔｒｉｓ碱、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。４．３．３　器材和设备ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器用吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。４．３．４　操作方法４．３．４．１　样品采集与处理４．３．４．１．１　样品采集发病可疑动物采集血液或口腔、泄殖腔拭子样品，保存于４℃或置于冷藏盒中；死亡动物无菌采集肝、脾、肾等组织样品；胚体采集绒毛尿囊膜或收集尿囊液；细胞培养物冻融后收获。４．３．４．１．２　样品处理组织样品需用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ按质量浓度配制成１０％悬液，匀浆或研磨，冻融３次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集上清液备用。拭子样品充分洗脱后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液备用。全血、尿囊液、细胞培养物等液状样品直接用于检测。４．３．４．２　对照样品制备４．３．４．２．１　阳性样品：将病毒ＤＰＶＦ３４株接种于长满单层的原代ＤＥＦ细胞（或原代ＤＥＫ细胞），３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置５％二氧化碳培养箱３７℃培养，逐日观察，待细胞病变（ＣＰＥ）达到约７５％时收获病毒悬液，小瓶分装，每瓶１ｍＬ，置－７０℃保存备用。４．３．４．２．２　阴性样品：原代细胞培养物。４．３．４．３　病毒犇犖犃抽提４．３．４．３．１　将４．２．２．３中分离样品或４．３．４．１．２中处理好的４００μＬ待测样品液加到１．５ｍＬ离心管中，以２００００犵离心２ｈ，沉淀病毒。４．３．４．３．２　弃去上清液，用２００μＬＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液重悬沉淀物。４．３．４．３．３　加５μＬ１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，终浓度为０．２μｇ／μＬ，充分混合，置５０℃温箱１ｈ。４．３．４．３．４　加入２５μＬ１０％ＳＤＳ，终浓度为１％，充分混合，３７℃１ｈ。４．３．４．３．５　加入１５μＬ５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，终浓度０．３ｍｏｌ／Ｌ，充分混合。４．３．４．３．６　加３００μＬ（用ｐＨ８．０ＴｉｒｉｓＨＣｌ）平衡的新鲜苯酚，颠倒混合５０次。４．３．４．３．７　１６０００犵离心５ｍｉｎ，将上层水相（样品）转移到一个新管中。４．３．４．３．８　重复步骤４．３．４．３．６和４．３．４．３．７中苯酚抽提步骤一次。４．３．４．３．９　管中加入５００μＬ乙醚，充分混合，１６０００犵离心１ｍｉｎ。４．３．４．３．１０　弃去上层水相（乙醚），重复乙醚抽提（步骤４．３．４．３．９）一次。４．３．４．３．１１　打开管盖，５６℃放置１５ｍｉｎ，或到闻不到乙醚气味。４．３．４．３．１２　将管中内容物分成两部分，每管加入２．２５倍样品体积的１００％乙醇，颠倒管子数次以混合管中内容物，室温放置３０ｍｉｎ。４犛犖／犜２７４４—２０１０４．３．４．３．１３　１６０００犵离心４５ｍｉｎ，弃去上清液。４．３．４．３．１４　加入２００μＬ７０％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后１６０００犵离心１５ｍｉｎ。４．３．４．３．１５　弃去上清液，打开管盖５６℃放置３０ｍｉｎ～４５ｍｉｎ干燥沉淀。４．３．４．３．１６　加入３０μＬ无ＲＮＡ酶