SNT 2670-2010 番茄环斑病毒检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!$%$番茄环斑病毒检疫鉴定方法$%&’&()*(+*,+()*-*.&)*/(/-)/0&)/’*(123/)4*’%2!$%$5%%5$%发布!$%%5$&5$%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、邓丛良、陈青、赵文军、黄文胜、廖富荣、林石明、朱水芳。Ⅰ犛犖／犜２６７０—２０１０番茄环斑病毒检疫鉴定方法１　范围本标准规定了番茄环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄环斑病毒的进境种子、苗木、组培苗等繁殖材料的检疫与鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１８６０　植物病毒免疫电镜检测方法ＳＮ／Ｔ２１２２　进出境植物及植物产品检疫抽样３　原理３．１　学名与分类地位学名：ｔｏｍａｔｏｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ缩写：ＴｏＲＳＶ分类地位：豇豆花叶病毒科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）；线虫传多面体病毒属（犖犲狆狅狏犻狉狌狊）。其他资料参见附录Ａ。３．２　粒体形态番茄环斑病毒粒体为等轴对称二十面体，直径２８ｎｍ。３．３　基因组基因组由两条单链正义ＲＮＡ组成，ＲＮＡ１为８．２ｋｂ，ＲＮＡ２为７．３ｋｂ。多个分离物的基因组已被测序，各分离物之间序列同源性较低，根据依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶编码区序列设计ＰＣＲ引物可检测烟草株系（Ｔｏｂａｃｃｏｓｔｒａｉｎ）、桃黄芽花叶株系（Ｐｅａｃｈｙｅｌｌｏｗｂｕｄｍｏｓａｉｃｓｔｒａｉｎ）、葡萄黄脉株系（Ｇｒａｐｅｙｅｌｌｏｗｖｅｉｎｓｔｒａｉｎ）及多个ＴｏＲＳＶ分离物。４　仪器设备、用具及试剂４．１　仪器设备酶联检测仪、天平（感量，１／１００００ｇ）、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、组织捣碎机、恒温水浴、低温冰箱等。４．２　用具微量移液器（２．５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）、酶联板、研钵等。１犛犖／犜２６７０—２０１０４．３　试剂酶联免疫吸附测定试剂（见附录Ｂ）、反转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）检测试剂（见附录Ｃ）。５　样品制备５．１　种子抽样按照ＳＮ／Ｔ２１２２的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于２５℃生长并进行症状观察。待长出３片～４片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（１０株为１组）并编号。５．２　苗木按ＳＮ／Ｔ２１２２规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于２５℃生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同５．１。６　检测方法６．１　酶联免疫吸附测定见附录Ｂ。６．２　犚犜犘犆犚检测见附录Ｃ。６．３　免疫电镜检测按照ＳＮ／Ｔ１８６０的规定执行。６．４　生物学测定参见附录Ｄ。７　结果判定６．１、６．２和６．３中的两种方法检测结果为阳性，即可判定检出番茄环斑病毒。酶联测定为阳性后，ＲＴＰＣＲ或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出番茄环斑病毒。必要时可进行生物学测定，并进行复验。８　样品保存８．１　样品保存经检验确定携带番茄环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在４℃，病株在－２０℃或者－８０℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。２犛犖／犜２６７０—２０１０８．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联极反应的原始数据，ＲＴＰＣＲ检测需有电泳结果图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片。３犛犖／犜２６７０—２０１０附　录　犃（资料性附录）番茄环斑病毒相关资料犃．１　寄主范围ＴｏＲＳＶ的自然寄主有天竺葵属（犘犲犾犪狉犵狅狀犻狌犿ｓｐｐ．）、悬钩子属（犚狌犫狌狊ｓｐｐ．）、李属（犘狉狌狀狌狊ｓｐｐ．）和烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）等。在人工接种的情况下还可以侵染茄科、藜科、葫芦科、蔷薇科和豆科的１００多种植物。犃．２　病害症状ＴｏＲＳＶ主要侵染多年生植物，在桃和其他李属植物上表现黄芽花叶症状；桃、樱桃和一些李属植物上表现茎部蚀损斑和退化症状；李树被ＴｏＲＳＶ侵染后产生褐色线条；ＴｏＲＳＶ侵染苹果树后嫁接部位上方膨大，接穗和砧木连接处的树皮异常增厚并呈海绵状，剖开树皮后可发现明显的坏死线，苹果树也可出现衰退症状；ＴｏＲＳＶ在红树莓（ｒｅｄｒａｓｐｂｅｒｒｙ）上表现环斑和衰退症状；葡萄等多种植物被ＴｏＲＳＶ侵染后均可出现衰退症状。犃．３　分布地区ＴｏＲＳＶ主要分布于美洲、欧洲、大洋洲、亚洲的一些国家：美国、加拿大、秘鲁、智利、保加利亚、德国、意大利、法国、前苏联地区、前南斯拉夫、塞浦路斯、澳大利亚和韩国、日本等。犃．４　传播方式犃．４．１　近距离传播ＴｏＲＳＶ在田间主要通过土壤中的剑线虫传播，剑线虫属中可能的传播介体有：犡犻狆犺犻狀犲犿犪犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿，犡．犮犪犾犻犳狅狉狀犻犮狌犿，犡．犻狀犮狅犵狀犻狋狌犿，犡．狅犮犮犻犱犻狌犿，犡．狉犻狏犲狊犻，犡．狋犺狅狉狀犲犻，犡．狌狋犪犺犲狀狊犲。机械接种、种子、花粉也能传播该病毒。犃．４．２　远距离传播ＴｏＲＳＶ通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。４犛犖／犜２６７０—２０１０附　录　犅（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定犅．１　试材犅．１．１　酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犅．１．２　包被抗体特异性的番茄环斑病毒抗体。犅．１．３　酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的番茄环斑病毒抗体。犅．１．４　底物对硝基苯磷酸二钠（ρＮＰＰ）。犅．１．５　样品抽提缓冲液（狆犎７．４）ＰＢＳＴ　　　　　　　　　　　　１Ｌ亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇＰＶＰ（ＭＷ２４０００～４００００）２０ｇ叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ４℃储存。犅．１．６　包被缓冲液（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。犅．１．７　犘犅犛犜缓冲液（洗涤缓冲液狆犎７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ吐温２００．５ｍＬ蒸馏水定容至１Ｌ。５犛犖／犜２６７０—２０１０犅．１．８　酶标抗体稀释缓冲液（狆犎７．４）ＰＢＳＴ１ＬＢＳＡ（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉２．０ｇＰＶＰ（ＭＷ２４０００～４００００）２０．０ｇ叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ４℃储存。犅．１．９　底物（狆犖犘犘）缓冲液（狆犎９．８）氯化镁（ＭｇＣｌ２）０．１ｇ叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ二乙醇胺９７ｍＬ溶于８００ｍＬ蒸馏水中，用盐酸调ｐＨ值至９．８，蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。犅．２　程序犅．２．１　包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，１００μＬ／孔，加盖，３７℃孵育２ｈ，清空孔中溶液，ＰＢＳＴ洗涤３次，每次３ｍｉｎ。犅．２．２　样品制备待测样品按１∶１０（质量∶体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。犅．２．３　加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，１００μＬ／孔，每一样品设一重复。加盖后于４℃冰箱孵育过夜，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤１次，ＰＢＳＴ洗涤３次，每次３ｍｉｎ。犅．２．４　加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，１００μＬ／孔，加盖，３７℃孵育４ｈ，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤１次，ＰＢＳＴ洗涤３次，每次３ｍｉｎ。犅．２．５　加底物将底物ρＮＰＰ加入到底物缓冲液中使终浓度为１ｍｇ／ｍＬ（现配现用），按１００μＬ／孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。犅．２．６　读数在不同的时间内如３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ，或更长时间，用酶联仪在４０５ｎｍ处读ＯＤ值，或用肉服观察显色情况。犅．３　结果判断犅．３．１　对照孔的ＯＤ４０５值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：６犛犖／犜２６７０—２０１０缓冲液孔和阴性对照孔的ＯＤ４０５值＜０．１５，当阴性对照孔的ＯＤ４０５值＜０．０５时，按０．０５计算；阳性对照ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值＞５～１０；同一样品的重复性基本一致。犅．３．２　在满足了Ｂ．３．１质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值＞２，判为阳性；样品ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值接近阈值，判为可疑样品，需重新做一次，或者任选６．２、６．３和６．４中的一种方法加以验证；样品ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值明显＜２，判为阴性。犅．３．３　若满足不了Ｂ．３．１质量要求，则不能进行结果判断。７犛犖／犜２６７０—２０１０附　录　犆（规范性附录）犚犜犘犆犚检测犆．１　试剂犆．１．１　ＴｒｉｚｏＬ裂解液。犆．１．２　５０×ＴＡＥ：Ｔｒｉｓ　　　　　　　　　２４２ｇ冰乙酸５２．１ｍＬＮａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ３７．２ｇ加去离子水定容至１Ｌ。用时加水稀释至１×ＴＡＥ。犆．１．３　６×加样缓冲液：０．２５％溴酚蓝４０％（质量浓度）蔗糖水溶液犆．２　实验步骤犆．２．１　总犚犖犃提取称取０．５ｇ植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的１．５ｍＬ离心管中，加入１ｍＬ的ＴｒｉｚｏＬ试剂，剧烈振荡摇匀３ｍｉｎ；４℃，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液；加入饱和苯酚三氯甲烷异戊醇（２５∶２４∶１），５００μＬ，上下颠倒混匀；４℃，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液；重复饱和苯酚三氯甲烷异戊醇抽提步骤１次；加０．６倍体积的异丙醇，颠倒混匀；４℃，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液；加７５％的乙醇洗涤沉淀，４℃，７５００犵离心２ｍｉｎ，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于３０μＬｄＨ２Ｏ（ＤＥＰＣ处理）中，－２０℃保存备用。也可采用其他有效的ＲＮＡ提取方法。犆．２．２　犚犜犘犆犚反应ＲＴＰＣＲ检测引物见表Ｃ．１。ｃＤＮＡ的合成：在０．２ｍＬ反应管中，加入总ＲＮＡ６μＬ，１μＬ下游引物（２０μｍｏｌ／Ｌ），ＤＤＷ４μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１μＬ，６５℃水浴５ｍｉｎ，取出后立即放在冰上，加入５×ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ４μＬ，４０Ｕ／μＬＲＮａｓｅＢｌｏｃｋＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１μＬ，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ２μＬ，４２℃水浴２ｍｉｎ，然后再加入２００Ｕ／μＬＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１μＬ，混匀后４２℃水浴５０ｍｉｎ，７０℃水浴１５ｍｉｎ，合成ｃＤＮＡ。ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ和ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。表犆．１　犚犜犘犆犚检测的引物检测基因引物序列复制酶上游引物ＴｏＲＳＶｒｅｐｆ：５’ｇＡＣｇＡＡｇＴＴＡＴＣＡＡＴｇｇＣＡｇＣ３’下游引物ＴｏＲＳＶｒｅｐｒ：５’ＴＣＣｇＴＣＣＡＡＴＣＡＣｇＣｇＡＡＴＡ３’８犛犖／犜２６７０—２０１０　　ＰＣＲ反应体系见表Ｃ．２。反应参数：９５℃／４ｍｉｎ；９５℃／１ｍｉｎ，５０℃／４５ｓ，７２℃／１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃／３ｍｉｎ。表犆．２　犘犆犚反应体系试剂名称加样量μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液２．５氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１．０上游引物（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５下游引物（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５犜犪狇酶（５Ｕ／μＬ）０．２ｃＤＮＡ模板２．０ｄｄＨ２Ｏ补足反应总体积为２５μＬ犆．２．３　琼脂糖电泳犆．２．３．１　制备凝胶将ＴＡＥ和电泳级琼脂糖按１．５％（质量浓度