SNT 2522.1-2010 进出口辐照食品检测方法 微生物学筛选法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２２．１—２０１０进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犻狉狉犪犱犻犪狋犲犱犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊犮狉犲犲狀犻狀犵犿犲狋犺狅犱２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言　　本标准的附录Ａ为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭利平、胡群、邹春颖。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法１　范围本标准规定了进出口食品是否经过辐照处理的微生物学快速筛选方法。本标准适用于冷冻禽肉、畜肉、水产品等各类生鲜食品是否经过辐照处理的快速筛选。本标准适用于从上述食品中筛选出可能经过辐照处理的食品，但不排除其他不破坏食品中内毒素的灭菌方法对该食品进行过处理。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ０３３０　出口食品中微生物学检验通则３　方法提要内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞外膜上的特有成分，食品经过一定剂量辐照处理后，食品中活的革兰氏阴性菌基本上会被杀死，但是所残留的内毒素，不会因为辐照处理而消失。因此可以通过对内毒素的定量测定来估计食品中被杀死和未被杀死的革兰氏阴性菌总数，结合食品中活的革兰氏阴性菌的培养计数，比较两者差异可以判断该食品是否经过辐照处理。４　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。４．１革兰氏阴性菌　犵狉犪犿狀犲犵犪狋犻狏犲犫犪犮狋犲狉犻犪，犌犖犅用革兰氏染色法染色后呈红色或土黄色的细菌，如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌等。４．２内毒素　犲狀犱狅狋狅狓犻狀内毒素又名脂多糖、类脂Ａ、热源，是革兰氏阴性菌的细胞外膜上特有成分，可以迅速地引起鲎血细胞裂解形成凝固。４．３内毒素检测　犾犻犿狌犾狌狊犪犿狅犲犫狅犮狔狋犲犾狔狊犪狋犲狋犲狊狋，犔犃犔内毒素可激活鲎试剂的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶，利用该现象可以对样品中存在的内毒素进行检测。５　设备和材料５．１　可调温水浴锅。１犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网５．２　高压灭菌锅。５．３　电热恒温培养箱。５．４　高温烘箱。５．５　涡旋振荡器。５．６　电子天平：感量为０．００１ｇ。５．７　均质器：８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ。５．８　灭菌吸管：１ｍＬ，具有０．１ｍＬ刻度。５．９　微量移液器：２０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ。５．１０　一次性注射用针筒：１００ｍＬ。５．１１　试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ。５．１２　灭菌培养皿：直径９０ｍｍ。５．１３　酒精灯。５．１４　灭菌剪刀。５．１５　纯水制备器。５．１６　石蜡封口膜。５．１７　微量离心管：１．５ｍＬ。５．１８　无热源安瓿瓶。６　培养基与试剂６．１　实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２二级水规格（电导率≤１．０μｓ／ｃｍ）。６．２　缓冲蛋白胨水（见附录第Ａ．１章）。６．３　营养琼脂培养基（见附录第Ａ．２章）。６．４　牛奶琼脂培养基（见附录Ａ．３．１）。６．５　结晶紫溶液（见附录Ａ．３．２）。６．６　青霉素溶液（见附录Ａ．３．３）。６．７　革兰氏阴性菌选择性培养基（见附录Ａ．３．４）。６．８　注射用无热源生理盐水。６．９　去离子水。６．１０　内毒素标准品：５０ＥＵ／管。６．１１　鲎试剂１）：灵敏度０．５ＥＵ／ｍＬ。１）　厦门鲎试剂厂生产的鲎试剂为适合市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效产品。７　样品抽样、贮存和运送７．１　抽样数量及抽样方法按ＳＮ／Ｔ０３３０进行。７．２　样品的贮存和运送样品应于４℃保存，２４ｈ内送往实验室检验，如不能立即检验，应置于－２０℃保存，最长保存时间不超过３０ｄ。８　检验程序辐照食品微生物学筛选法检验程序见图１。２犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网图１　辐照食品微生物学筛选法检验程序９　检验步骤９．１　制样无菌条件下于样品的不同部位取样，共取１０ｇ样品于已灭菌的塑料容器中，用一次性针筒加９０ｍＬ注射用无热源生理盐水，以８０００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１０－１样品稀释液，于４℃下保存备用，最长保存时间不超过２４ｈ。９．２　革兰氏阴性菌培养计数９．２．１　培养基制备制备缓冲蛋白胨水、营养琼脂培养基、革兰氏阴性菌选择性培养基（参见附录Ａ），倾注平板前将融化的培养基于４５℃±１℃水浴保温。３犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网９．２．２　接种和培养９．２．２．１　根据样品污染情况，对样品稀释液（１０－１）作进一步的稀释，用缓冲收蛋白胨水对样品稀释液按照９ｍＬ比１ｍＬ的体积比进行１０倍梯度稀释，得到１０－２～１０－５样品稀释液。９．２．２．２　把保持在４５℃±１℃的营养琼脂培养基约１０ｍＬ倾入培养皿中，水平放置，待琼脂冷却凝固，加入０．１ｍＬ的不同稀释度的稀释液涂布后于２０℃～２５℃下静置９０ｍｉｎ。每个稀释度做两个平板。９．２．２．３　每个平板覆盖１０ｍＬ革兰氏阴性菌选择性培养基，使样液与培养基充分混合。水平放置，使琼脂凝固。倒置平板于２１℃±１℃培养箱中培养４８ｈ±１ｈ。９．２．２．４　选择菌落数为１５～３００的２个连续稀释度平板计数（见表１中例１）。按式（１）计算每克样品中的革兰氏阴性菌数犖（ＣＦＵ／ｇ）：犖＝∑犮犞［狀１＋（０．１×狀２）］犱…………………………（１）　　式中：犖———每克样品中革兰氏阴性菌数，ＣＦＵ／ｇ；∑犮———长有１５～３００菌落的２个连续稀释度平板的菌落之和；犞———每个平板接种的菌液体积，单位为毫升（ｍＬ）；狀１———第一个稀释度的计数平板数；狀２———第二个稀释度的计数平板数；犱———计数有效平板的第一个稀释度。若只有一个稀释度的平板长有１５～３００个菌落时，则狀２计为０（见表１中例２）。若所有稀释度的平板菌落数均小于１５时，则以菌落数最多的平板的菌落数作为犖值的估计值（见表１中例３）。若所有稀释度的平板菌落均未长菌时，结果表示为未检测到革兰氏阴性菌，犖值计为０（见表１中例４）。表１　革兰氏阴性菌菌落数计算示例例次稀释液及菌落数１０－１１０－２１０－３１０－４计算方式１＞３００＞３００＞３００＞３００２５６２３６１６１８犖＝２５６＋２３６＋１６＋１８０．１（２＋０．２）×１０－３＝２．３９×１０６２７８５３６２２１０１犖＝７８＋５３０．１×２×１０－１＝６．５５×１０３３４５２３００００犖＝５４００００００００犖＝０９．３　内毒素检测９．３．１　原理在适宜条件下，细菌内毒素可激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据内毒素的含量测定革兰氏阴性菌的污染程度。９．３．２　样品稀释取３００μＬ样品稀释液，加入装有６５０μＬ无热源生理盐水的１．５ｍＬ已高温高压灭菌的微量离心管中，稀释倍数为１０－０．５，按照相同的体积比，将样品稀释液作进一步梯度稀释，稀释倍数视样品情况而定，要求最后一个稀释倍数的样品内毒素检测为阴性。９．３．３　内毒素标准品溶解与稀释取一管内毒素标准品，加入１ｍＬ无热源生理盐水溶解为５０ＥＵ／ｍＬ的内毒素标准品溶液，同４犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网９．３．２样品稀释法进行不同倍数稀释。９．３．４　鲎试剂溶解与分装按试剂标示量，加入无热源生理盐水溶解，混匀，注意不要引起气泡，以每支０．１ｍＬ分装于安瓿瓶内。９．３．５　鲎试剂检测以内毒素标准品溶液作为阳性对照，无热源生理盐水作为阴性对照，取０．１ｍＬ稀释样品与分装的０．１ｍＬ鲎试剂混匀，用石蜡封口膜封口，于３７℃±１℃的水浴锅中静止放置６０ｍｉｎ±２ｍｉｎ，当试剂发生完全凝集时记为“＋”，部分凝集时记为“＋／－”，未凝集时记为“－”。９．３．６　内毒素定量根据不同稀释倍数内毒素标准品溶液的检测情况确定检测鲎试剂的灵敏度。以发生凝固的最后一个样品稀释溶液的滴度用于计算，如果完全凝固时，以实际滴度用于计算（见表２中例１），如果为部分凝固“＋／－”时，则以该倍数的指数减去０．２５后作为滴度值用于计算（见表２中例２）。按式（２）计算每克样品中内毒素含量犔犃犔（ＥＵ／ｇ）：犔犃犔＝犮×１０狋×１０１０犜…………………………（２）　　式中：犔犃犔———每克样品中内毒素含量，ＥＵ／ｇ；犮———标准品中内毒素含量，ＥＵ／ｍＬ；狋———样品的滴度值；犜———标准品的稀释倍数。表２　内毒素滴度计算示例例　次稀释度及内毒素反应情况１０－０．５１０－１．０１０－１．５１０－２．０１０－２．５１０－３．０滴　度１＋＋＋＋——２．０２＋＋＋＋／－——１．７５９．４　结果报告９．４．１　计算ｌｏｇ１０犔犃犔、ｌｏｇ１０犖和ｌｏｇ１０犔犃犔－ｌｏｇ１０犖值。９．４．２　当样品经检测含有较高的内毒素含量，但经培养的革兰氏阴性菌数目较少或者未检测出有可培养的革兰氏阴性菌，即经计算ｌｏｇ１０犔犃犔－ｌｏｇ１０犖值大于０，报告为该样品可能经过辐照处理。９．４．３　若样品经检测含有较高的内毒素含量，经培养的革兰氏阴性菌数目较多，经计算ｌｏｇ１０犔犃犔－ｌｏｇ１０犖值小于或等于０，报告为该样品未经过辐照处理。９．４．４　当样品中内毒素含量较低（ｌｏｇ１０犔犃犔＜２）并且经培养的革兰氏阴性菌数目较少（ｌｏｇ１０犖＜２），报告为本方法不适用。５犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网附　录　犃（规范性附录）培　养　基犃．１　缓冲蛋白胨水犃．１．１　成分氯化钠　　　　　　　　　　　８．５ｇ酪蛋白酶１．０ｇ去离子水１０００ｍＬ犃．１．２　制法将上述各成分混匀，不断加热搅拌溶解，调ｐＨ为７．０±０．２，分装试管，高压灭菌１２１℃±１℃，１５ｍｉｎ，４℃±１℃保存备用，可储藏１４ｄ。犃．２　营养琼脂培养基犃．２．１　成分氯化钠５．０ｇ酪蛋白酶５．０ｇ牛肉膏１．０ｇ酵母提取物２．０ｇ琼脂９．０ｇ～１８．０ｇ（根据琼脂的凝胶性能决定）去离子水１０００ｍＬ犃．２．２　制法将上述各成分加热煮沸溶解后，调ｐＨ为７．４±０．２，高压灭菌１２１℃±１℃，１５ｍｉｎ，冷却至４５℃～５０℃备用。犃．３　革兰氏阴性菌选择性培养基犃．３．１　牛奶琼脂培养基犃．３．１．１　成分酵母提取物２．０ｇ蛋白胨５．０ｇ奶粉１．０ｇ琼脂１５．０ｇ乳酸链球菌肽（１．０×１０６单位）１．６ｍｇ去离子水９９７ｍＬ犃．３．１．２　制法将上述各成分加热煮沸溶解后，调ｐＨ为７．４±０．２，高压灭菌１２１℃±１℃，１５ｍｉｎ，冷却至４５℃～５０℃备用。犃．３．２　结晶紫溶液犃．３．２．１　成分结晶紫１０．０ｍｇ去离子水１０．０ｍＬ６犛犖／犜２５２２．１—２０１０食品伙伴网犃．３．２．２　制法溶液用０．２２ｎｍ滤膜过滤后备用，４℃～６℃可储藏１４ｄ。犃．３．３　青霉素溶液犃．３．３．１　成分青霉素Ｇ（８０万单位）２．５ｍｇ去离子水１０．０ｍＬ犃．３．３．２　制法溶液用０．２２ｎｍ滤膜过滤后备用，４℃～６℃可储藏１ｄ。犃．３．４　革兰氏阴性菌选择性培养基犃．３．４．１　成分青霉素