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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖/犜2515—2010牛结节疹检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犾狌犿狆狔狊犽犻狀犱犻狊犲犪狊犲20100302发布20100916实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准牛结节疹检疫技术规范SN/T2515—2010中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址www.spc.net.cn电话:68523946 68517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16 印张0.75 字数15千字2010年5月第一版 2010年5月第一次印刷印数1—1600书号:155066·220828 定价16.00元书书书前 言本标准的附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:邱杨、鱼海琼、林志雄、唐丽霞、赵丽、李艳霞、黄名秋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖/犜2515—2010牛结节疹检疫技术规范1 范围本标准规定了牛结节疹电镜观察、病毒分离、血清中和试验等诊断方法。本标准适用于牛结节疹的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略词适用于本标准。3.1LSD:牛结节疹。3.2EDTA:乙二胺四乙酸。3.3GMEM:Glasgow改良Eagle’s培养基。3.4CPE:致细胞病变作用。3.5H&E:苏木精伊红染色。3.6LT:羔羊睾丸。3.7PBS:磷酸盐缓冲液。3.8NB:营养肉汤。3.9BHK21:幼仓鼠肾细胞。3.10BEK:牛肾细胞。3.11Vero:非洲绿猴肾细胞。4 试剂和材料4.1 三蒸水应符合GB/T6682要求。4.2 肝素或EDTA。1犛犖/犜2515—20104.3 10%福尔马林。4.4 含抗生素的PBS缓冲液(pH7.2):配制方法见附录A。4.5 GMEM。4.6 无水丙酮。4.7 石蜡膜或蜡板。4.8 pH7.8TrisEDTA缓冲液:配制方法见附录A。4.9 pH7.8,1%磷钨酸:配制方法见附录A。4.10 牛结节疹病毒Neethling毒株。4.11 原代或次代LT细胞。4.12 采用MEM培养液,加10%犊牛血清,2%水解乳蛋白,100μg/mL青霉素,100μg/mL链霉素,100μg/mL制霉菌素。4.13 待检血清:无菌静脉采血,分离血清,并于56℃灭活30min。4.14 阳性血清:同毒株来源。4.15 阴性血清:阴性牛场健康牛血清。5 器材和设备5.1 解剖镜。5.2 水浴锅。5.3 恒温箱。5.4 普通冰箱和超低温冰箱。5.5 台式离心机。5.6 细胞培养板。5.7 细胞培养箱。5.8 二氧化碳培养箱。5.9 20μL~200μL微量移液器。5.10 倒置显微镜。5.11 电子显微镜。6 电镜观察6.1 取新鲜的皮肤结节,制备组织悬液,用透射电镜观察。方法是:取一滴悬液于石蜡膜或蜡板上,将400目六角形电子显微镜网格浮在其上,该网格具有绒毛状碳基质并在戊胺蒸气经光激活用。1min后,将网栅转移到一滴pH7.8TrisEDTA缓冲液中20s,然后,转到一滴pH7.8,1%的磷钨酸中,10s。用滤纸吸去水分,空干,置于电子显微镜下观察。山羊痘病毒粒子如砖状,周围覆盖有短管状结构,大小约为(290×270)nm,有些病毒粒子周围有宿主细胞膜包围,因此需尽可能多观察以确认病毒形态。6.2 在电镜下,山羊痘病毒很难与正痘病毒区别,且其形态学上与牛痘和痘病毒没有区别,但牛很少发生痘病毒和牛痘病毒感染,也不引起全身性感染,其他正痘病毒则均不引起牛发病。而副痘病毒在电镜下其形态小于痘病毒,呈卵圆形,外面有单个连续管状结构,像沟槽覆盖在病毒粒子周围,能与牛型山羊痘病毒区分开来。7 病毒分离试验7.1 样品的采集、送检和制备7.1.1 血液样品的采集与制备在LSD病毒血症期出现全身病灶之前或4d内,采集血液,加入肝素或EDTA抗凝(用于病毒分离2犛犖/犜2515—2010的加有抗凝剂的血液样品应立即放置在冰浴上,最好尽快处理。样品在处理前4℃可放置2d,但不宜冷冻或常温保存)。将抗凝血液以2000r/min离心15min,小心吸取上清液中含病毒的血沉棕黄层,无菌移入5mL冷双蒸水中,30s后,加入5mL冷的双倍浓度的生长培养基,如GMEM进行混合,混合物2000r/min离心15min,弃上清液,收集血沉棕黄层移入到5mL生长培养基中,还可再离洗一遍用于病毒培养。7.1.2 病灶组织样品的采集与制备病毒分离和抗原检测材料在尸体解剖时采集,包括:皮肤结节、肺病灶,或淋巴结及病灶周围的组织。采集的时间以临床症状出现后,中和抗体出现前的第一周内为宜。采集的样品应立即放进10倍体积的10%福尔马林中,置4℃冰浴或-20℃保存。如果样品没有冷藏条件需要运送,应加入含有10%甘油的运输液,样品块应足够大,以避免运输液渗到组织当中。将病灶材料无菌制成匀浆,加入到等体积含复合抗生素的PBS缓冲液中,继续研磨,逐渐制成10%~20%的组织悬液。冻融3次,8000r/min离心15min,取上清液于5mL的生长培养基中,可用于病毒培养。7.2 病毒分离培养及鉴定7.2.1 病毒分离培养分离该病毒多以LT细胞最为敏感。取上述用于病毒培养的培养液1mL接入己生长好的LT细胞培养瓶中,置37℃吸附1h后,用温PBS洗去培养液,再加10mL细胞培养液培养。也可用含有LT细胞和飞片的组织培养管,或者感染的组织培养显微镜载玻片。连续14d观察培养瓶的CPE,如果培养液混浊更换培养液。其CPE特征是细胞膜皱缩到细胞圆缩,核染色体边缘化。最初看到小面积的CPE,4d~6d波及整个细胞层。14d后如未发现CPE,培养物应该冻融3次,取上清液接种新鲜的LT细胞并做二次培养。如出现CPE征兆或感染飞片出现CPE,则进行特异性鉴定。7.2.2 鉴定取上述培养物用丙酮固定,以H&E染色。由于山羊痘病毒在细胞内产生特异性的CPE和胞浆内包涵体,所以当看到相当于细胞核的一半、大小不一、且周边有清晰晕的呈亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体,即可诊断为痘病毒感染。8 血清学中和试验8.1 细胞株LSD病毒可以用牛、绵羊或山羊的组织细胞进行培养,如能在羔羊及犊牛的肾或睾丸细胞、绵羊胚胎的肾和肺细胞、鸡胚成纤维细胞等原代细胞以及BEK、Vero和BHK21等传代细胞中增殖并产生病变,而以LT细胞较为敏感,尤以毛用绵羊羔睾丸细胞最为敏感。8.2 标准毒株山羊痘病毒标准株,通常是在组织培养中生长良好的疫苗株,滴度大于log106TCID50/mL。目前国际上已有两株山羊痘病毒疫苗株。一株为在LT或胎牛肌细胞上传18代的肯尼亚绵羊痘和山羊痘病毒,另一株来自南非,此株已在羔羊肾细胞上传60代和在鸡胚绒毛尿囊膜上传20代。鉴于山羊痘病毒对组织培养敏感性不同的特性,因此,推荐使用肯尼亚标准毒株及对本病毒较敏感的原代或次代LT细胞,以确保中和试验结果的一致性。8.3 犔犛犇微量血清中和试验程序8.3.1 步骤8.3.1.1 用96孔微量细胞培养板。将待检血清作1∶5稀释。取培养液160μL加入第一、第四、第七和第十纵列各孔内,取一份待检血清40μL加入第一排(横排,下同)的第1孔内,稀释后各吸取50μL至同排的第2、第3孔内。取另一份待检血清40μL加入第二排的第1孔内,稀释后各吸取50μL至同排的第2、第3孔内。依次类推稀释各待检血清。每份血清均滴定3孔,第1孔为待检血清毒性对照(即第一、四、七、十纵列各孔为待检血清毒性对照孔,不加工作病毒抗原),后两孔为滴定试验孔。3犛犖/犜2515—20108.3.1.2 用培养液稀释病毒至100TCID50/50μL。加入50μL工作病毒抗原置滴定试验孔中。每一块96孔培养板可检验32份血清。8.3.1.3 将培养板置5%的二氧化碳培养箱37℃感作1h。8.3.1.4 每孔加已培养好的3×105mL细胞悬液100μL。8.3.1.5 置37℃二氧化碳培养箱进行培养9d,连续观察CPE。8.3.1.6 同时做病毒回归试验以测定病毒实际TCID50。8.3.2 对照8.3.2.1 阳性血清和阴性血清均按被检血清进行。8.3.2.2 病毒回归试验,即重新测定病毒的TCID50。将病毒抗原做10倍系列稀释至10-8,每个稀释度加4孔,每孔加50μL,补加50μL培养液,再加入细胞悬液100μL,计算试验所用50μL病毒液含有实际的TCID50。8.3.3 结果判定8.3.3.1 用倒置显微镜从第4大起每天观察细胞CPE变化,当病毒抗原对照、阴性血清对照均出现CPE、阳性血清对照无CPE,待检血清对细胞无毒性,对照细胞生长正常,抗原实际用量在50TCID50/50μL~150TCID50/50μL范围内方能判定结果,第9天终判,抗体效价滴定判读标准是以待检血清最高稀释度50%保护为该待检血清的中和效价,以能保护细胞免于破坏的血清最高稀释度为该血清滴度。 8.3.3.2 中和滴度大于等于1∶5为阳性,小于1∶5为阴性。8.3.3.3 每次试验中,阳性对照血清滴度不应比其已知效价差1个滴度以上,回归滴度变化应在50TCID50~150TCID50之间。8.3.4 结果解释通常血清中和试验是最特异的血清学试验方法,但LSD感染后主要是细胞免疫,阴性结果免疫应答较温和,并非意味着动物没有产生抗体,而动物感染LSD病毒仅产生低水平的中和抗体,因而不够敏感。因此在采用中和试验结果的同时,结合临床症状(参见附录B)等方法做最终判定。4犛犖/犜2515—2010附 录 犃(规范性附录)试剂配制犃.1 肝素125IU/mL血液终浓度封管。犃.2 犈犇犜犃EDTA用量为1.5mg/mL~2.5mg/mL血液终浓度。EDTA母液需分装,高压灭菌,4℃保存。犃.3 10%甘油运输液Hank’s平衡盐10倍浓缩液氯化钠(NaCl) 80g氯化钾(KCl) 4.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g氯化镁(MgCl2·6H2O)1.0g氯化钙(CaCl2)1.4g葡萄糖10g双蒸水800mL配制方法:依照上列顺序称取各试剂,并依次溶解于双蒸水中,定容至1000mL,分装,高压灭菌,贮存于室温或4℃。使用前,取Hank’s平衡盐10倍浓缩液,用灭菌双蒸水稀释至工作液,并含复合抗生素及10%甘油,即为10%甘油运输液。犃.4 狆犎7.0磷酸盐缓冲液(犘犅犛)的配制A液氯化钠(NaCl) 8.0g氯化钾(KCl)0.2g氯化钙(CaCl2·2H2O)0.132g氯化镁(MgCl2·2H2O)0.1g双蒸水100mLB液磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g双蒸水200mL依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中。以0.104MPa~0.112MPa15min高压灭菌A液和B液。冷却后,将B液缓慢倒入A液中搅拌均匀。分装于500mL~1000mL灭菌瓶中。取1mL~5mL接于NB(营养肉汤)中进行无菌检验。5犛犖/犜2515—2010贮存于4℃或室温。犃.5 复合抗生素青霉素钠盐,每毫升含1000国际单位(IU/mL),硫酸链霉素1mg/mL,制霉菌素100IU/mL,或两性霉素2.5μg/mL和新霉素200IU/mL。犃.6 苏木精伊红染色苏木精1g氧化汞0.5g乙醇10mL硫酸铝钾(或硫酸铝铵)20g去离子水200mL犃.6.1 配制a) 在酒精内溶解苏木精,在水内溶解硫酸铝钾,加热助溶;b) 混合苏木精
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