SNT 2497.16-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第16部分Western-Blot实

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１６—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１６部分：犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋实验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１６：犠犲狊狋犲狉狀　犅犾狅狋２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１６部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、于艳军、赵好力宝、王华、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１６—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１６部分：犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋实验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验的术语和定义、主要试剂、试验步骤和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品安全试验ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验。２　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋一般称为免疫着色或免疫印迹，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。２．２第一抗体　犳犻狉狊狋犪狀狋犻犫狅犱狔以待测蛋白质作为抗原的对应抗体。２．３第二抗体　狊犲犮狅狀犱犪狀狋犻犫狅犱狔以碱性磷酸酶标记的，能够与第一抗体结合的抗体。３　试剂３．１　转移缓冲液称取甘氨酸２．９ｇ，Ｔｒｉｓ碱５．８ｇ，十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）０．３７ｇ，加适量水使固体溶解后，加入甲醇２００ｍＬ，补水至１０００ｍＬ。３．２　１０×丽春红犛贮存液称取丽春红Ｓ２ｇ，三氯乙酸３０ｇ，磺基水杨酸３０ｇ，加水溶解，定容至１００ｍＬ，室温保存，用时稀释１０倍。３．３　犜犅犛溶液称取Ｔｒｉｓ碱３ｇ、ＮａＣｌ８ｇ和０．２ｇＫＣｌ，加水溶解后，用稀盐酸调ｐＨ值至７．４，定容至１０００ｍＬ，在１．０３４×１０５Ｐａ（１５ｌｂｆ／ｉｎ２）高压下蒸汽灭菌２０ｍｉｎ，室温保存。３．４　犜犅犛犜溶液在ＴＢＳ中按１∶１０００加入Ｔｗｅｅｎ２０，室温保存。３．５　碱性磷酸酶缓冲液１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ（ｐＨ值９．５），１００ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，室温保存。３．６　氮蓝四唑（犖犅犜）贮存液０．５ｇＮＢＴ溶于１０ｍＬ７０％二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）中。３．７　５溴４氯３吲哚磷酸盐（犅犆犐犘）贮存液０．５ｇＢＣＩＰ溶于１０ｍＬ二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）中。１犛犖／犜２４９７．１６—２０１０３．８　磷酸盐缓冲液（犘犅犛）称取８ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇＮａ２ＨＰＯ４和０．２４ｇＫＨ２ＰＯ４，溶于８００ｍＬ蒸馏水中，用ＨＣｌ调节ｐＨ值至７．４，定容至１０００ｍＬ，１．０３４×１０５Ｐａ（１５ｌｂｆ／ｉｎ２）高压下蒸汽灭菌２０ｍｉｎ，室温保存。４　试验步骤４．１　聚丙烯酰胺凝胶的准备将进行完ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳后的凝胶浸泡于转移缓冲液中。４．２　半干法转移蛋白质将硝酸纤维素滤膜和六张相同尺寸的普通滤纸于转移缓冲液中浸泡５ｍｉｎ。由下至上安装转移装置：阳极板三层滤纸滤膜凝胶三层滤纸阴极板，根据凝胶面积按０．６５ｍＡ／ｃｍ２接通电流，转移１．５ｈ～２ｈ。将转移后的硝酸纤维素滤膜用水冲洗，丽春红染色，然后标记标准蛋白质的位置并用水冲洗干净。如采用预染标准蛋白，可省却此步骤。４．３　封闭用封闭液（含５％脱脂奶粉的ＴＢＳ）于平板摇床上摇动封闭１ｈ。４．４　第一抗体结合按０．１ｍＬ／ｃｍ２的量加入适当比例稀释的第一抗体，在室温下持续摇动１ｈ以上。弃去第一抗体工作液，用ＴＢＳＴ洗涤滤膜５ｍｉｎ，更换ＴＢＳＴ后再洗涤２０ｍｉｎ再次更换ＴＢＳＴ后洗涤５ｍｉｎ，最后用ＴＢＳ洗涤滤膜５ｍｉｎ。４．５　第二抗体结合加入第二抗体工作液室温下持续摇动１ｈ。弃去第二抗体工作液，以ＴＢＳＴ漂洗硝酸纤维素滤膜三次，每次１０ｍｉｎ，最后用ＴＢＳ漂洗滤膜５ｍｉｎ。４．６　显色配制生色底物：将６６μＬＮＢＴ贮存液加入到１０ｍＬ碱性磷酸酶缓冲液中，混匀，然后加入３３μＬＢＣＩＰ贮存液，３０ｍｉｎ内使用。按滤膜面积加入０．１ｍＬ／ｃｍ２的生色底物，当蛋白条带的颜色深度达到要求后，取出滤膜，浸入２００μＬ０．５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）和５０ｍＬＰＢＳ中。５　结果保存拍摄滤膜照片，保存结果，滤膜可用热封机封合后保存。２犛犖／犜２４９７．１６—２０１０书书书０１０２—６１７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１６部分：犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋实验ＳＮ／Ｔ２４９７．１６—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４９　定价１４．００元