SNT 2497.19-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第19部分Northern Blot

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１９—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１９部分：犖狅狉狋犺犲狉狀犅犾狅狋实验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１９：犜犲狊狋狅犳犖狅狉狋犺犲狉狀犅犾狅狋２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１９部分。本部分修改采用《分子克隆实验指南》第二版，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、李晶、李学洋、赵好力宝、吕刚。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１９—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１９部分：犖狅狉狋犺犲狉狀犅犾狅狋实验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和结果分析。本部分适用于检测进出口危险化学品引起的基因转录异常。２　术语、定义和缩略语２．１　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１．１核酸探针　狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狆狉狅犫犲能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。２．２　缩略语下列缩略语适用于本部分。２．２．１　犕犗犘犛３（犖玛琳代）丙磺酸２．２．２　犚犖犃核糖核酸３　原理在变性条件下将待检的ＲＮＡ样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的ＤＮＡ或ＲＮＡ探针进行杂交和放射自显影。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，从而显示出待检ＲＮＡ的片段及其相对大小。４　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。４．１　５×甲醛凝胶电泳缓冲液：０．１ｍｏｌ／ＬＭＯＰＳ（ｐＨ值７．０），４０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸钠，５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）。４．２　甲醛凝胶加样缓冲液：５０％甘油，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯青ＦＦ。４．３　溴化乙锭溶液：０．５μＬ／ｍＬ，用０．１ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵配制。４．４　２０×ＳＳＣ溶液：在８００ｍＬ水中溶解１７５．３ｇＮａＣｌ和８８．２ｇ柠檬酸钠，加入数滴１０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液调节ｐＨ值至７．０，加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌。４．５　２×ＳＳＣ，由２０×ＳＳＣ溶液稀释而成。４．６　杂交液：５０％甲酰胺，５×ＳＳＰＥ，２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ试剂，０．１％ＳＤＳ。５　仪器设备５．１　电泳仪。１犛犖／犜２４９７．１９—２０１０５．２　凝胶成像系统。６　试验步骤６．１　甲醛琼脂糖凝胶电泳６．１．１　制备凝胶：将适量琼脂糖溶于水，冷却至６０℃，加入５×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终液浓度分别为１×和２．２ｍｏｌ／Ｌ（将１２．３ｍｏｌ／Ｌ甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和５×甲醛凝胶电泳缓冲液按１∶３．５∶１．１比例混合）。在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置３０ｍｉｎ或更长时间，是凝胶凝固。６．１．２　样品制备：将以下几种溶液：ＲＮＡ（３０μｇ）　　　　　　　４．５μＬ５×甲醛凝胶电泳缓冲液２．０μＬ甲醛３．５μＬ甲酰胺１０．０μＬ于６５℃温浴１５ｍｉｎ，冰浴冷却，离心５ｓ使管内所有液体集中于管底，加２μＬ灭菌的并经用ＤＥＰＣ处理的甲醛凝胶加样缓冲液。６．１．３　加样前，将凝胶预电泳５ｍｉｎ，电压降为５Ｖ／ｃｍ，随后将样品加至凝胶加样孔。６．１．４　将凝胶浸入１×甲醛凝胶电泳缓冲液中，（３～４）Ｖ／ｃｍ电压降进行电泳。６．１．５　电泳结束后（溴酚蓝迁移出去约８ｃｍ），切下相对分子质量标准参照物的凝胶条，浸入溴化乙锭溶液中染色（３０～４５）ｍｉｎ。在紫外灯下照像，测量照片上每个ＲＮＡ条带至加样孔的距离，以ＲＮＡ片段大小的１ｇ对数值对ＲＮＡ条带的迁移距离作图，用所得曲线计数从凝胶转移到固相支持体通过杂交所检出的ＲＮＡ分子的大小。６．１．６　毛细管洗脱法将ＲＮＡ自琼脂糖凝胶转至硝酸纤维素滤膜。６．１．７　将凝胶移至一个玻璃干烤皿内，用刀片修去凝胶的无用部分，做好标记。６．１．８　用长和宽约大于凝胶的一块有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大干烤皿内，上面放一张滤纸，倒入２０×ＳＳＣ使页面略低于平台表面，当平台上方的３ＭＭ滤纸湿透后，用玻棒赶出所有的气泡。６．１．９　裁一张长度和宽度分别比凝胶大１ｍｍ的硝酸纤维素滤膜，浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用２０×ＳＳＣ浸泡滤膜至少５ｍｉｎ，做好标记。６．１．１０　将凝胶翻转后置于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。６．１．１１　在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气泡。６．１．１２　用２×ＳＳＣ溶液浸湿两张与凝胶同样大小的滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜上方，用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。６．１．１３　用保鲜膜在四周封边，切一叠［（５～８）ｃｍ高］略小于滤纸的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一５００ｇ的重物压实。６．１．１４　使上述ＲＮＡ转移持续进行（６～１８）ｈ，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。６．１．１５　转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的滤纸上，标记凝胶加样孔的位置。６．１．１６　从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以６×ＳＳＣ溶液于室温浸泡滤膜５ｍｉｎ。６．１．１７　从６×ＳＳＣ溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干３０ｍｉｎ以上。６．１．１８　将晾干的滤膜放在两张３ＭＭ滤纸中间，用真空炉于８０℃干烤（０．５～２）ｈ。６．１．１９　仅适用于滤膜上含有乙醛酰ＲＮＡ的情况：杂交前需要２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ（ｐＨ８．０）于６５℃２犛犖／犜２４９７．１９—２０１０洗膜，除去ＲＮＡ上的乙二醛分子。６．２　杂交和放射自显影６．２．１　加入杂交液，４２℃预杂交（１～２）ｈ。６．２．２　加入变性的放射性标记探针，在适宜温度下继续孵育（１６～２４）ｈ。６．２．３　用１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ于室温洗膜２０ｍｉｎ，随后用０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ于６８℃洗膜３次，每次２０ｍｉｎ。６．２．４　用Ｘ光片进行放射自显影，于－７０℃曝光（２４～４８）ｍｉｎ。７　试验结果用凝胶成像系统对Ｘ光片进行拍照、作图，并用图像分析软件进行结果分析。犛犖／犜２４９７．１９—２０１０书书书０１０２—９１．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１９部分：犖狅狉狋犺犲狉狀犅犾狅狋实验ＳＮ／Ｔ２４９７．１９—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数７千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９５２　定价１４．００元