SNT 2497.21-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第21部分琼脂糖凝胶电泳试验

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２１—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２１：犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２１部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吕刚、王利兵、李晶、张颖、赵好力宝、庞震。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２１—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品琼脂糖凝胶电泳的术语和定义及操作步骤。本部分适用于进出口危险化学品琼脂糖凝胶电泳试验。２　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１琼脂糖凝胶电泳　犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊一种简便高效的分离和纯化ＤＮＡ片断的方法。由于ＤＮＡ分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，ＤＮＡ分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的ＤＮＡ泳动速度不一样，因而可依据ＤＮＡ分子的大小来使其分离。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。３　试剂和材料３．１　电泳缓冲液：可根据实验要求和实际情况根据表１选择适当缓冲液。表１　常用电泳缓冲液缓冲液贮存液（１Ｌ）Ｔｒｉｓ乙酸（ＴＡＥ）５０×２４２ｇＴｒｉｓ碱，５７．１ｍＬ冰乙酸，１００ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）Ｔｒｉｓ磷酸（ＴＰＥ）１０×１０８ｇＴｒｉｓ碱，１５．５ｍＬ８５％磷酸，４０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）Ｔｒｉｓ硼酸（ＴＢＥ）５×５４ｇＴｒｉｓ碱，２７．５ｇ硼酸，２０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）碱性缓冲液１×５ｍＬ１０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ，２ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０）　　注：碱性缓冲液应现用现配。３．２　溴化乙锭溶液：工作液０．５μｇ／ｍＬ，避光保存。溴化乙锭是强烈诱变剂，使用时必须戴手套。３．３　电泳级琼脂糖：根据要分离的ＤＮＡ片段大小按照表２选择配制适当浓度的琼脂糖凝胶。表２　不同含量琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖含量／％线状ＤＮＡ分子的有效分离范围（ｋｂ）０．３５～６００．６１～２００．７０．８～１００．９０．５～７１．２０．４～６１．５０．２～３２．００．１～２３．４　加样缓冲液。１犛犖／犜２４９７．２１—２０１０３．５　ＤＮＡ相对分子质量标准品。４　仪器和设备４．１　水平板电泳槽。４．２　电泳仪。４．３　微波炉。５　操作步骤５．１　凝胶的制备５．１．１　称取需要量电泳级的琼脂糖于一烧瓶中，取适量的电泳缓冲液加入烧瓶中。在微波炉中融化琼脂糖，旋转使之均匀混合。５．１．２　待琼脂糖冷却至５５℃，加入溴化乙啶，倒入插有样孔梳的凝胶灌制平板上，去除气泡。５．１．３　待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。５．２　上样５．２．１　在电泳槽中加入足量的电泳缓冲液，盖住凝胶并超过胶高１ｍｍ。５．２．２　将所制备的ＤＮＡ样本加上加样缓冲液混匀，总量不能超过凝胶孔的容积，用微量加样枪将样本加入凝胶孔中，并加入适量的ＤＮＡ相对分子质量标志物。５．３　电泳５．３．１　连接导线，使ＤＮＡ在凝胶中向阳极移动，设定电压强度，一般是１Ｖ／ｃｍ～５Ｖ／ｃｍ，开始电泳。５．３．２　当加样缓冲液中的溴酚蓝染料迁移的距离足以判断ＤＮＡ片段的分离时，关闭电源，电泳结束。５．４　观察和分析将电泳结束的凝胶直接置于紫外灯下进行观察，如有成像系统可进行拍照，并根据试验目的进行初步分析。２犛犖／犜２４９７．２１—２０１０书书书０１０２—１２．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验ＳＮ／Ｔ２４９７．２１—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９５４　定价１４．００元