SNT 2497.14-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第14部分SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１４部分：犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１４：犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲狆狅犾狔犪犮狉狔犾犪犿犻犱犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺犲狉犲狊犻狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞（ＵＤＳ）试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１４部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张园、王利兵、赵琢、王华、李学洋、徐斌。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１４部分：犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳试验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验的主要试剂、试验步骤和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验。２　原理ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅＰｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｅｓｉｓ），在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），蛋白质样品就会与ＳＤＳ结合形成带负电荷的复合物，由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量也不同，在电泳中反映出不同的迁移率。根据标准蛋白质样品在电泳中的迁移率和相对分子质量所作出的标准曲线就可以推算出蛋白质样品相对分子质量的近似值。３　主要试剂３．１　３０％丙烯酰胺取丙烯酰胺２９ｇ和１ｇＮ，Ｎ’亚甲双丙烯酰胺溶于６０ｍＬ水中，加热至３７℃溶解，补加水至终体积为１００ｍＬ，过滤除菌，避光，４℃保存。３．２　１犿狅犾／犔犜狉犻狊溶液（狆犎６．８）称取１２．１ｇＴｒｉｓ碱加水至接近１００ｍＬ，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ调ｐＨ值至６．８，补水至１００ｍＬ，４℃保存。３．３　１．５犿狅犾／犔犜狉犻狊溶液（狆犎８．８）称取１８．２ｇＴｒｉｓ加水至接近１００ｍＬ，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ调ｐＨ值至８．８，补水至１００ｍＬ，４℃保存。３．４　１０％过硫酸铵贮存液用去离子水配制小量１０％的贮存液保存于４℃，１周内使用。３．５　５×甘氨酸电泳缓冲液１５．１ｇＴｒｉｓ碱，９４ｇ甘氨酸，再加入５０ｍＬ１０％的ＳＤＳ，补水至１０００ｍＬ，室温保存。３．６　１×犛犇犛凝胶加样缓冲液５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ（ｐＨ６．８），１００ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ＤＴＴ），２％ＳＤＳ（电泳级），０．１％溴酚蓝，１０％甘油，ＤＴＴ临用时现加。３．７　染色液先将０．２５ｇ考马斯亮蓝Ｒ２５０溶于９０ｍＬ甲醇水溶液（体积比为１∶１）和１０ｍＬ冰乙酸的混合液中，过滤。３．８　脱色液９０ｍＬ甲醇与水（体积比为１∶１）和１０ｍＬ冰乙酸的混合液。１犛犖／犜２４９７．１４—２０１０４　试验步骤４．１　变性将样品置于１×ＳＤＳ样品缓冲液中，于１００℃加热３ｍｉｎ使蛋白质变性。４．２　制胶根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶浓度，见表１和表２。表１　配制１０犿犔不同浓度犜狉犻狊甘氨酸犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液单位为毫升溶　液　成　分凝　胶　浓　度６％８％１０％１２％１５％水５．３４．６４．０３．３２．３３０％丙烯酰胺溶液２．０２．７３．３４．０５．０１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）２．５２．５２．５２．５２．５１０％ＳＤＳ０．１０．１０．１０．１０．１１０％过硫酸铵０．１０．１０．１０．１０．１ＴＥＭＥＤ０．００８０．００６０．００４０．００４０．００４表２　配制５犿犔５％犜狉犻狊甘氨酸犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳积层胶所用溶液单位为毫升溶　液　成　分体　　积水３．４３０％丙烯酰胺溶液０．８３１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）０．６３１０％ＳＤＳ０．０５１０％过硫酸铵０．０５ＴＥＭＥＤ０．００５４．３　上样取处理好的待测蛋白样品各（１０～２０）μＬ上样，未加蛋白样品的齿道应加上等体积１×ＳＤＳ样品缓冲液。４．４　电泳凝胶上所加电压为８Ｖ／ｃｍ，当染料进入分离胶后，把电压提高到１５Ｖ／ｃｍ，继续电泳直到溴酚蓝达到分离胶底部，然后关闭电源。４．５　染色将凝胶置于５倍体积的染色液中，平板摇床上室温染色４ｈ以上。４．６　脱色将凝胶置于脱色液中，平板摇床上脱色（４～８）ｈ，其间更换脱色液（３～４）次。５　试验结果将脱色后的胶拍照后，剪一块比胶稍大的滤纸，将胶置于滤纸之上，用干胶机干胶后保存。２犛犖／犜２４９７．１４—２０１０书书书０１０２—４１７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１４部分：犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳试验ＳＮ／Ｔ２４９７．１４—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４７　定价１４．００元