SNT 2497.13-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第13部分荧光原位杂交试验

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１３部分：荧光原位杂交试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１３：犉犾狅狉犲狊犮犲狀犮犲犻狀狊犻狋狌犺狔犫狉犻犱犻狕犪狋犻狅狀２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１３部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张园、王利兵、王华、赵琢、韩伟、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１３部分：荧光原位杂交试验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品荧光原位杂交试验的主要试剂和材料、主要仪器、试验步骤、试验结果和试验报告。本部分适用于进出口危险化学品荧光原位杂交试验。２　术语、定义和缩略语２．１　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１．１核酸探针　狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狆狉狅犫犲能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。２．２　缩略语下列缩略语适用于本部分。２．２．１犇犃犘犐　４’，６犱犻犪犿犻犱犻狀狅２狆犺犲狀狔犾犻狀犱狅犾犲　４，６联脒２苯基吲哚２．２．２犘犅犛　磷酸盐缓冲液２．２．３犘犐　犘狉狅狆犻犱犻狌犿犐狅犱犻狀犲　碘化丙啶３　原理荧光原位杂交技术（ＦｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，简称ＦＩＳＨ）是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的ＤＮＡ探针与待测样本的ＤＮＡ进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常组织样本进行检测。４　主要试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。４．１　ＰＢＳ：在８００ｍＬ蒸馏水中溶解８ｇＮａＣｌ，０．２ｇＫＣｌ，１．４４ｇＮａ２ＨＰＯ４和０．２４ｇＫＨ２ＰＯ４，用ＨＣｌ调节溶液的ｐＨ值至７．４，加水定容至１Ｌ，在１．０３４×１０５Ｐａ（１５１ｂｆ／ｉｎ２）高压下灭菌２０ｍｉｎ，保存于室温。４．２　２０×ＳＳＣ：在８００ｍＬ水中溶解１７５．３ｇＮａＣｌ和８８．２ｇ柠檬酸钠，加入数滴１０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液调节ｐＨ值至７．０，加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌。４．３　２×ＳＳＣ，由２０×ＳＳＣ溶液稀释而成。４．４　变性液：４ｍＬ２０×ＳＳＣ；８ｍＬ蒸馏水；２８ｍＬ甲酰胺。每次新鲜配制。４．５　杂交液：５×ＳＳＣ，５０％甲酰胺（５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ，１００μＬ待检ＤＮＡ，１０％硫酸葡聚糖）。１犛犖／犜２４９７．１３—２０１０４．６　杂交后洗涤液：２０×ＳＳＣ４ｍＬ，蒸馏水１６ｍＬ，甲酰胺２０ｍＬ。每次新鲜配制。４．７　梯度乙醇。４．８　１×ＰＢＤ：４×ＳＳＣ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ溶液。４．９　ＰＩ或ＤＡＰＩ。５　主要仪器５．１　恒温箱。５．２　荧光显微镜。６　试验方法６．１　用犚犖犪狊犲处理标本片将铺有染色体或细胞的玻片放入含有１００μｇ／μＬＲＮａｓｅ的溶液中６０℃（７０℃）２×ＳＳＣ室温洗４次，２ｍｉｎ／次７０％乙醇８０％乙醇９５％乙醇在－２０℃中进行脱水２ｍｉｎ／次室温干燥。６．２　变性７０℃变性液中孵育２ｍｉｎ，然后立即移入预冷的７０％乙醇中作用２ｍｉｎ，再依次移入８０％、９０％和１００％的－２０℃预冷乙醇内，每次２ｍｉｎ，室温干燥。６．３　杂交６．３．１　将玻片放在小盒（平皿）内，底层与少许水，保持玻片有一定湿度，３７℃，３０ｍｉｎ。６．３．２　探针变性：取１．５ｍＬ生物素标记ＤＮＡ探针（１０μｇ／μＬ）加入到３０μＬ杂交液中，混匀后放入７０℃水浴变性５ｍｉｎ后迅速放入冰冷却后加到玻片上（每张玻片３０μＬ）用盖玻片盖好，置３７℃，４ｈ～６ｈ。６．３．３　去掉盖玻片，浸入洗涤液中，４３℃洗２０ｍｉｎ，然后用２×ＳＳＣ３７℃洗２次，再浸入１×ＰＢＤ溶液中。６．４　杂交信号显示６．４．１　将玻片从１×ＰＢＤ溶液中取出，平放在玻片架上，加６０μＬ封闭液１，用石蜡膜盖好，室温下作用５ｍｉｎ。６．４．２　去掉石蜡膜，加６０μＬ荧光标记Ａｖｉｄｉｎ（抗生物素蛋白）３７℃，２０ｍｉｎ。６．４．３　在１×ＰＢＤ溶液中洗片３次，每次２ｍｉｎ。６．４．４　杂交信号放大，在玻片上加６０μＬ封闭液２，室温下作用５ｍｉｎ，加抗Ａｖｉｄｉｎ的抗体３７℃，２０ｍｉｎ。６．４．５　用１×ＰＢＤ洗３次，再次２ｍｉｎ（室温）加终止液１．６μＬ，室温５ｍｉｎ加荧光标记Ａｖｉｄｉｎ，３７℃，２０ｍｉｎ，用１×ＰＢＤ洗３次。６．４．６　染色体显色，在玻片上加１０μＬＰＩ或ＤＡＰＩ等荧光染料，再加抗荧光淬灭剂封片液室温反应５ｍｉｎ，加盖玻片在荧光显微镜下观察。７　试验结果可采取镜下计数细胞、照相的方法，或可采用专业荧光原位杂交分析系统进行结果分析。２犛犖／犜２４９７．１３—２０１０书书书０１０２—３１．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１３部分：荧光原位杂交试验ＳＮ／Ｔ２４９７．１３—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４６　定价１４．００元