SNT 1315-2010 牛地方流行性白血病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１５—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３牛地方流行性白血病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犲狀狕狅狅狋犻犮犫狅狏犻狀犲犾犲狌犽狅狊犻狊２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言　　本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３《牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３相比，主要变化如下：———标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》；———增加了临床诊断部分；———实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：———对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善。本标准的附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赖平安、高志强、吴丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３。Ⅰ犛犖／犜１３１５—２０１０食品伙伴网牛地方流行性白血病检疫技术规范１　范围本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１９１７　牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程３　缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１犈犅犔牛地方流行性白血病。３．２犅犔犞牛白血病病毒。３．３犉犅犔胎牛肺。３．４犚犐犃放射性免疫试验。３．５犘犆犚聚合酶链反应。３．６犃犌犐犇琼脂凝胶免疫扩散。３．７犈犔犐犛犃酶联免疫吸附试验。４　临床诊断４．１　流行病学牛感染ＢＬＶ后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自１８７８年发现于德国以来，目前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的１犛犖／犜１３１５—２０１０食品伙伴网日本也因输入性传播导致该病在全国蔓延。４．２　临床症状牛白血病的潜伏期较长，可达４年～５年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。４．３　病理变化感染ＢＬＶ后，病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。５　实验室诊断５．１　病原分离及鉴定５．１．１　原理ＢＬＶ是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是Ｂ淋巴细胞。ＢＬＶ不仅以前病毒的形式存在于感染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等）中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或ＢＬＶ抗原测定法鉴定。也可直接用ＰＣＲ检查外周血和肿瘤中存在的ＢＬＶ前病毒ＤＮＡ。５．１．２　材料准备５．１．２．１　器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（－２０℃保存血清，－７０℃保存种毒），无菌９６孔细胞培养板，微量可调移液器（５０μＬ、１００μＬ），微量滴头，吸管（５ｍＬ、１０ｍＬ）。５．１．２．２　试剂：淋巴细胞分离液、２０％胎牛血清的ＭＥＭ培养液和细胞分散液配制见附录Ａ。５．１．２．３　胎牛肺细胞：无菌采取出生犊牛肺，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置３７℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。５．１．３　样品制备５．１．３．１　样品采集用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放入４℃冰箱保存，在２４ｈ内送到实验室。５．１．３．２　样品处理取１．５ｍＬ抗凝血，轻轻加入等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放入另一离心管中，以ＰＢＳ洗涤后备用。５．１．４　病毒分离取５．１．３．２得到的淋巴细胞与２×１０６ＦＢＬ细胞在４０ｍＬ含２０％胎牛血清的ＭＥＭ中共同培养，置于３７℃５％二氧化碳培养箱，逐日观察细胞变化，并在３ｄ～４ｄ后收获培养物上清，保存于－７０℃待鉴定。５．１．５　病毒鉴定病毒致细胞变化特点是细胞产生合胞体。取上述细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清通过ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ或ＡＧＩＤ等方法检测其中是否含有ｐ２４和ｇｐ５１抗原，并通过电子显微镜观察上清中包含的病毒粒子，或者用ＰＣＲ方法检测上清中的ＢＬＶ前病毒核酸（方法见ＳＮ／Ｔ１９１７），从而确诊样品中是否包含有ＢＬＶ。２犛犖／犜１３１５—２０１０食品伙伴网５．２　血清学试验５．２．１　琼脂凝胶免疫扩散试验５．２．１．１　原理抗原及其特异性抗体在凝胶中呈自由扩散形式，不同抗原在凝胶中的扩散速度不同，当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，其相对分子质量增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。ＡＧＩＤ即根据抗原与阳性血清之间出现的沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。５．２．１．２　材料准备５．２．１．２．１　器材和设备：吸管、量筒、量杯、三角瓶、平皿（直径９０ｍｍ）、７孔梅花样金属打孔器（内径５ｍｍ）、微量移液器（０．１μＬ～５０μＬ，０μＬ～１００μＬ），观察灯，温箱（２５℃）。５．２．１．２．２　试剂：ＰＢＳ（０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２）和琼脂糖凝胶平板配制方法见附录Ｂ。５．２．１．２．３　标准抗原：由指定单位提供。由感染ＥＢＬ病毒的胎羊肾细胞（ＦＬＫ）培养液经提取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白（ｇｐ）为主，并含核蛋白（ｐ）的混合抗原，试验时与阳性血清之间应在２４ｈ内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之间不得出现任何沉淀线。５．２．１．２．４　标准阳性血清：由指定单位提供。能与标准抗原在２４ｈ内产生明显的细直而致密的一条沉淀线（ｇｐ抗体），末端接触两侧相邻孔的边缘。５．２．１．３　样品制备被检血清，用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经５６℃３０ｍｉｎ灭活处理，保存于４℃，时间不宜超过３周。５．２．１．４　操作方法５．２．１．４．１　打孔按图１和图２的模式在制备好的琼脂板上打孔，孔径为５ｍｍ，孔间距３ｍｍ，反应孔现用现打。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，切勿损坏边缘以及使琼脂层脱离平皿，为防止渗漏，最好封底。图１图２３犛犖／犜１３１５—２０１０食品伙伴网５．２．１．４．２　加样七孔型（如图１所示），中央孔加抗原（Ｇ），１、４孔加标准阳性血清，２、３、５、６孔分别加三份被检血清；六十三孔型（如图２所示），按图“Ｇ”孔加抗原。“＋”孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清（同时可检查４０份样品）。每孔均以加满不溢出为度，约５０μＬ／孔，每加一个样品应换一个吸头。５．２．１．４．３　反应加样完毕后，静置１０ｍｉｎ，将平皿水平倒置，放入湿盒，置于２０℃～２５℃作用，分别在２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ观察并记录结果。５．２．１．５　结果判定５．２．１．５．１　判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立。５．２．１．５．２　判定标准阳性：出现清晰致密的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相融合（如图３所示６孔）。被检血清可能在此沉淀线的外侧，还出现粗而直的第二条沉淀线，这是ｐ沉淀线（核蛋白ｐ２４与其特异性抗体形成的沉淀线）（如图３所示６孔）。图３　　弱阳性：不出现沉淀线，但两侧标准阳性血清形成的沉淀线末端向被检血清孔弯曲（如图３所示５孔）。凡弱阳性者应重复试验一次，如仍为弱阳性则判为阳性，否则判为阴性。阴性：不出现沉淀线，且相邻孔的标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘（如图３所示２孔）。非特异性反应：出现的沉淀线粗而浑浊并与标准阳性血清形成的沉淀线交叉并直伸，为非特异反应（如图３所示３孔）。应重新试验，若仍出现非特异反应则判为阴性。５．２．２　间接酶联免疫吸附试验５．２．２．１　原理利用抗原抗体的特异性反应，用ＢＬＶ抗原直接包被微量反应板，或先用ＢＬＶ多克隆或者单克隆抗体进行包被之后捕获所加入的ＢＬＶ抗原，当待测的血清或奶样品中含有相应的特异性抗体时，则可与所包被的抗原相结合，并能继续与加入的酶标记的抗牛ＩｇＧ抗体结合形成复合物。随后加入的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，颜色反应的深浅可与样品中相应抗体的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值，从而判定待测样品中是否含有牛白血病病毒的特异性抗体（本标准只作定性用）。５．２．２．２　材料准备５．２．２．２．１　器材和设备：９６孔微量反应板，酶标测定仪，单孔道或多孔道微量移液器，振荡器，３７℃恒温箱。５．２．２．２．２　ＥＬＩＳＡ所用溶液：包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、底物显色液及终止液的配方详见附录Ｃ，各种试剂均为分析纯试剂。５．２．２．２．３　ＢＬＶ抗原：由指定单位提供。与ＡＧＩＤ相同的制备方式从病毒感染的细胞培养液中提取，并用包被缓冲液稀释后用。４犛犖／犜１３１５—２０１０食品伙伴网５．２．２．２．４　ＢＬＶ标准阳性和阴性血清：由指定单位提供，使用时经５６℃３０ｍｉｎ灭活处理。５．２．２．２．５　抗牛ＩｇＧ抗体：由指定单位提供。５．２．２．３　样品制备被检血清：用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经５６℃３０ｍｉｎ灭活处理，保存于４℃，时间不宜超过３周。被检奶样：所采集的奶样需在４℃冰箱中放置２４ｈ～４８ｈ，直至乳脂层形成，期间不能振荡；或者也可于２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ使奶样形成乳脂层，在检测前，将所形成的乳脂层去除。５．２．２．４　操作方法５．２．２．４．１　包被ＢＬＶ抗原和阴性对照抗原分列依次包被微量反应板，每孔１００μＬ，４℃过夜。５．２．２．４．２　洗涤取出包被过夜的酶标板，甩掉孔内的包被液，加入洗涤液至反应孔的顶端，静置１ｍｉｎ～２ｍｉｎ或甩干，并用吸水纸沥干，如此重复３次，也可用洗板机洗涤。５．２．２．４．３　封闭每孔加入２００μＬ封闭液，置３７℃温箱孵育９０ｍｉｎ，甩掉液体按５．２．２．４．２所述标准程序进行洗涤。５．２．２．４．４　加样及抗体吸附检测血清样品时，先在用于检测样品的反应孔中，每孔加入１００μＬ稀释液。之后在ＢＬＶ抗原包被孔和阴性对照抗原包被孔中分别加入４μＬ待检血清样品，同时设阳性和阴性血清对照，每份样品需重复测定两孔。检测奶样时，将１００μＬ待检奶样、阳性和阴性奶样分别加入ＢＬＶ抗原和阴性抗原包被的两种反应孔中，每份样品需重复测定两孔。将加好样的酶标板在振荡器上充分振荡混匀后，３７℃孵育１ｈ。５．２．２．４．５　加酶标二抗将上述反应板按５．２．２．４．２所述标准程序进行洗涤后，每孔加入用洗涤液稀释的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的抗体１００μＬ，３７℃孵育１ｈ。５．２．２．４．６　显色将上述反应板按５．２．２．４．２所述标准程序进行洗涤后，每孔加入１００μ