SNT 1139-2002 蚕豆染色病毒血清学检测方法

蚕豆染色病毒血清学检测方法SerologicaldetectionmethodofbroadbeanstaincomovirusSN／T1139—2002前   言   本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。   本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：陶庭典、许志刚、易建平、印丽萍、杨翠云。   本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1范围   本标准规定了蚕豆染色病毒的DAS-ELISA检测方法。   本标准适用于蚕豆种子、种苗及其他相关作物中蚕豆染色病毒的检测。检测蚕豆及其他作物种子内的病毒时，其种子须经发芽或种植并形成小苗后再进行检测。2缩略语   以下缩略语适用于本标准。   DAS-ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附分析法   PBS磷酸缓冲液   10×PBS10倍浓度的PBS母液，用来快速配制PBS缓冲液   PBST含吐温一20的PBS   SEB样品抽提液   IgG指纯化的蚕豆染色病毒抗体IgG   Coating—IgG指用于包被酶联板的蚕豆染色病毒的抗体IgG   IgG-conjugate指用碱性磷酸酶标记过的蚕豆染色病毒的抗体IgG   CB包被缓冲液3方法提要及其依据   蚕豆染色病毒是Lloyd等于1965年在英国的蚕豆上发现的。它是一种直径约28nm的球状病毒。主要分布在非洲和欧亚地区。蚕豆染色病毒属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)。蚕豆染色病毒具有中等强度的免疫源性，产生的抗体可以用作各种血清学反应。感病叶片汁液中含有较多的病毒粒体，可以通过血清学反应进行检测。血清学方法中的DAS—ELISA是一种稳定性好、特异性强的方法，本标准采用被国内外广泛使用的DAS-ELISA方法检测蚕豆染色病毒。4仪器设备4.1酶联板。4.2可调式移液器(2.5μL：10μL、100μL、200μL、1000μL各一支)及相应吸头。4.312孔道200μL可调式移液器及吸头。4.4酸度计。4.5调温水浴锅或调温培养箱。4.6ELISA洗板机(不是本标准所要求的)。   。4.7酶标仪。4.8微量样品榨汁机(无微量样品榨汁机时，用研钵进行手工研磨制样)。4.9量筒(10mL、20mL、50mL、100mL、500mL、1000mL各一个)。4.10分析天平：精度1／10000g。4.11试剂瓶(10mL、50mL、100mL、500mL、1000mL各两个)。4.12封口膜。4.13吸水纸。5试剂、溶液及生物制剂   本标准中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。5.110×PBS的配制   a)81.8g氧化钠；   b)1.49g氯化钾；   c)2.72g磷酸二氢钾；   d)14.2g磷酸氢二钠(Na2HP04.2H20)；   e)加水定容至1L。5.2PBS的配制   a)100mL10×PBS；   b)850mL水；   c)调节pH至7.4后再用水定容至lL。5.3PBST的配制   在PBS中加入Tween一20，使Tween一20的浓度为0.1％。5.4SEB的配制   在PBS中加入以下试剂配制SEB   a)聚乙烯吡咯烷酮(使其终浓度为2％)；   b)卵白蛋白(使其终浓度为0.2％)；   c)Tween一20(使其终浓度为0.05％)；   d)NaN3(使其终浓度为0.05％)。5.5CB的配制   a)1.59g碳酸钠；   b)2.94g碳酸氢钠，   c)0.50g叠氮化钠；   d)900mL水；   e)调节pH至9.6后再用水定容至1L。5.6ELISA底物的配制   用10％二乙醇胺溶液将对硝基苯磷酸配制成1mg／mL的浓度(现配现用)。5.7包被用IgG   纯化的蚕豆染色病毒抗体IgG，使用国内外正式注册的商品，根据供应商的要求用SEB稀释为工作浓度。5.8IgG-conjugate   碱性磷酸酶标记的蚕豆染色病毒抗体，使用国内外正式注册的商品，用SEB稀释为工作浓度。6样品6.1阳性对照样品：蚕豆染色病毒的纯病毒或者病组织，由抗血清供应商提供，用SEB制备。6.2阴性对照样品：由抗血清供应商提供，用SEB制备。6.3空白对照：SEB作空白对照。6.4待测样品的制备6.4.1待检测的样品为种苗时，将叶片用SEB作为抽提液(样品与SEB的比率为1:10左右)进行榨汁，榨汁工具为微量样品榨汁机，没有微量样品榨汁机的则手工研磨，所得汁液直接用于检测。6.4.2待检测的样品为种子时，应先将种子发芽后再进行检测。方法是：用3％次氯酸钠进行表面消毒约10min，无菌水洗三次，放在用湿润的吸水纸铺底的培养皿或瓷盘内，于室温下培养直至种子发芽，发芽时间根据种子的不同一般要一周至二周左右；或者在消毒的土壤内直接种植，待长出小苗后再进行检测。7检测方法   本标准要求在以下反应过程中，酶联板处于37℃或4℃冰箱过夜时，必须用封口膜或者酶联板自带的盖板对酶联板进行封盖以防止反应液的蒸发。7.1用CB将蚕豆染色病毒的抗体IgG根据供应商的说明稀释到工作浓度后，按每孔100μL的量包被酶联板。7.237℃下放置1h或4℃冰箱过夜。7.3按每孔200μL的量用PBST洗板四次以上，每次1min。(可用洗板机洗板，也可手工洗板，下同)。7.4按每孔100μL的量加入待测样品，必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。并且待测样品、阳性对照、阴性对照和空白对照各至少有一个重复。7.537℃下放置1h或4℃冰箱过夜。7.6按每孔200μL的量用PBST洗板四次以上，每次1min。7.7按每孔100μL的量加入工作浓度的酶标抗体。7.837℃下放置1h或4℃冰箱过夜。7.9按每孔200μL的量用PBST洗板四次，每次1min。7.10将底物按每孔80μL的量加入到酶联板，37℃显色30min～60min后，每孔加入50μL3mol／L的氢氧化钠终止反应。7.11用酶标仪于405nm处测定结果。8检测结果的判定   将反应结果用酶标仪于405nm处读数，当样品的吸光值P大于0.25、阴性对照的吸光值N小于0.1且P／N大于2.5时，判为阳性，否则判为阴性。9样品的保存   对于检测结果显示为阳性的样品，必须对样品进行保存。当样品为种子时，将样品保存在4℃冰箱内；当样品为种苗时，应将样品用SEB制成汁液，装入塑料样品管内或者离心管内于一40℃或者更低的温度下保存。