SNT 2863-2011 马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊（犲犪狊狋犲狉狀犪狀犱狑犲狊狋犲狉狀）２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《陆生动物手册（２００９版）第２．５．５章“马脑脊髓炎（东部型和西部型）”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：———细化了免疫荧光试验方法；———细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法；———增加了血凝试验内容；———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ；———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明。Ⅰ犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范１　范围本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、ＲＴＰＣＲ试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样３　缩略语下列缩略语适用于本文件。３．１　ＥＥＥ（ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东部型马脑脊髓炎３．２　ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西部型马脑脊髓炎３．３　ＶＥＥ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎３．４　ＷＮ（ｗｅｓｔｎｉｌｅｆｅｖｅｒ）：西尼罗河热３．５　ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系３．６　Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系３．７　ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆转录聚合酶链式反应４　生物安全要求本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。实验人员需提前进行ＥＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶４０以上。５　样品采集５．１　试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）。５．２　采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１犛犖／犜２８６３—２０１１５．３　采集方法５．３．１　血清样品采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．２　脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．３　组织样品无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６　病原分离鉴定６．１　病毒分离６．１．１　设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２　试剂和材料６．１．２．１　ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２　ＭＥＭ培养基。６．１．２．３　３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４　６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５　胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６　样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７　细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３　操作方法６．１．３．１　样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２　细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％体积加入样品悬液，３７℃感作１ｈ～２ｈ后加入细胞维持液，３７℃培养６ｄ～８ｄ，逐日观察细胞病变。每份样品接种ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞各２瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细胞反复冻融３次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现７０％～９０％细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验鉴定。２犛犖／犜２８６３—２０１１６．１．３．３　鸡胚分离每份样品接种２枚～４枚６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚卵黄囊，０．５ｍＬ／枚，孵化７ｄ。弃２４ｈ内死亡鸡胚，收集２４ｈ后死亡鸡胚，用ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代。６．１．４　结果判定６．１．４．１　细胞分离试验细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变，判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验。６．１．４．２　鸡胚分离试验若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验。６．２　免疫荧光试验６．２．１　设备和器材二氧化碳培养箱、生物安全（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置荧光显微镜、低温冰箱、超低温冰箱、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管和移液器等。６．２．２　试剂和材料６．２．２．１　丙酮。６．２．２．２　Ｖｅｒｏ细胞。６．２．２．３　ＭＥＭ培养基。６．２．２．４　０．５％伊文思蓝染色液。６．２．２．５　ＥＥＥＶ和ＷＥＥＶ病毒储液。６．２．２．６　阴性血清（和一抗来源相同）。６．２．２．７　一抗［ＥＥＥＶ抗体和（或）ＷＥＥＶ抗体］。６．２．２．８　ＦＩＴＣ标记二抗（ＦＩＴＣ标记物种特异性抗体）。６．２．２．９　ＦＩＴＣ标记一抗［ＥＥＥＶ抗体和（或）ＷＥＥＶ抗体］。６．２．２．１０　细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．２．２．１１　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．２．２．１２　ＰＢＳ溶液，配制见Ａ．３．１。６．２．２．１３　封闭溶液（含封闭液１和封闭液２），配制见Ａ．３．２。６．２．２．１４　封固溶液，配制见Ａ．３．３。６．２．３　操作方法６．２．３．１　准备试验６．２．３．１．１　加入ＡＴＶ缓冲液，将Ｖｅｒｏ细胞传代到Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，３７℃，５％二氧化碳培养１ｄ～２ｄ。待细胞长至８０％～１００％，取０．１ｍＬ待鉴定的分离培养物感染Ｖｅｒｏ细胞，每个样品接种６支～７支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，同时设立１支～２支正常培养细胞对照。用ＭＥＭ培养基将ＥＥＥＶ和ＷＥＥＶ病毒储液稀释到１００ＴＣＩＤ５０～１０００ＴＣＩＤ５０后感染Ｖｅｒｏ细胞，作阳性对照。加入适量细胞维持液，３７℃，５％二氧化碳培养。３犛犖／犜２８６３—２０１１６．２．３．１．２　逐日取出一块玻片，ＰＢＳ溶液润洗一次，－７０℃预冷丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。６．２．３．１．３　滴加ＦＩＴＣ标记一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ后，ＰＢＳ溶液润洗一次。６．２．３．１．４　用新鲜ＰＢＳ溶液浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水润洗１次，空气中干燥，滴加一滴封固溶液，加盖片，用荧光显微镜（４９０ｎｍｏｌ／Ｌ）进行观察。确定出最佳感染效果后，将余下的玻片固定备用。６．２．３．１．５　组织冰冻切片，丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；组织涂片空气中干燥３０ｍｉｎ，丙酮固定。将固定好的片子密闭、保存于－７０℃备用。６．２．３．２　染色６．２．３．２．１　直接免疫荧光抗体法每个样品同时做两张片子，分别用封闭液１和封闭液２进行封闭，３７℃湿盒孵育３０ｍｉｎ，滴加ＦＩＴＣ标记一抗，按６．２．３．１．２～６．２．３．１．４进行孵育、洗涤、干燥和观察。６．２．３．２．２　间接免疫荧光抗体法滴加一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。ＰＢＳ润洗一次后，再用新鲜ＰＢＳ浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水润洗一次，置玻片架上，细胞面向上，滴加ＦＩＴＣ标记二抗，按６．２．３．１．２～６．２．３．１．４进行孵育、洗涤、干燥和观察。用相同比例稀释的阴性血清作阴性对照。注：工作浓度未知的一抗，可以作１∶１０，１∶２０，１∶４０，１∶８０，１∶１６０梯度稀释，作用于阳性对照进行染色。６．２．４　结果判定阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且阴性血清对照无特异性荧光，试验成立；样品呈现特异性荧光，判定为阳性；样品无特异性荧光，判定为阴性。６．３　逆转录聚合酶链式反应（犚犜犘犆犚）６．３．１　设备和器材生物安全柜、低温冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机（≥１２０００犵）、ＰＣＲ仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪（或ＵＶ灯）、微量移液器（０．５μＬ～１０００μＬ）及配套枪头等。６．３．２　试剂和材料６．３．２．１　Ｔｒｉｚｏｌ试剂。６．３．２．２　２０ｍｇ／μＬ糖原。６．３．２．３　１０×ＰＣＲ缓冲液。６．３．２．４　２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。６．３．２．５　２００ｕｎｉｔｓ／μＬＭＭＬＶ逆转录酶。６．３．２．６　１０ｕｎｉｔｓ／μＬ核糖核酸酶抑制剂。６．３．２．７　ＷＮ、ＥＥＥ和ＷＥＥ阳性对照。６．３．２．８　阴性对照。６．３．２．９　５ｕｎｉｔｓ／μＬＡｍｐｌｉ犜犪狇ＧｏｌｄＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１）ＤＮＡ聚合酶。１）　该聚合酶是ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。６．３．２．１０　１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）。６．３．２．１１　乙醇、异丙醇、三氯甲烷、ＴＡＥ缓冲液、双蒸水（无ＲＮＡｓｅ）、琼脂糖、ＤＮＡ电泳载样缓冲液、４犛犖／犜２８６３—２０１１ＤＮＡ相对分子质量标准、ＤＮＡ凝胶染色剂。６．３．３　操作步骤６．３．３．１　犚犖犃提取分别取组织悬液（或血浆、分离培养物）和阴、阳性对照２５０μＬ，加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ。振荡混匀，冰上静置５ｍｉｎ。加入２００μＬ三氯甲烷，旋涡振荡１５ｓ，冰上静置５ｍｉｎ。１２０００犵，２℃～８℃，离心１５ｍｉｎ。取５００μＬ上层液与等体积－２０℃预冷异丙醇混合，加１μＬ糖原，室温静置１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ后，１２０００犵，２℃～８℃，离心１０ｍｉｎ沉淀ＲＮＡ。弃上清液，加入１ｍＬ７０％乙醇，轻轻混匀，保存于－７０℃。临用前，取出保存于乙醇中的样品和对照ＲＮＡ，７５００犵，２℃～８℃离心５ｍｉｎ。弃上清液，将离心管倒扣在灭菌纱布上，室温干燥５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，加入１５μＬ无ＲＮａｓｅ水，溶解ＲＮＡ。６．３．３．２　第一轮犚犜犘犆犚按表１配制第一轮ＲＴＰＣＲ反应液。每管加入ＲＮＡ２μＬ，按照逆转录：４５℃４５ｍｉｎ；预变性：９５℃１０ｍｉｎ；３４个循环：９５℃３０ｓ，５８℃４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ；补充延伸：７２℃５ｍｉｎ；４℃保温，进行反应。表１　第一轮犚犜犘犆犚反应液单位为微升试　　　剂ＲＴＰＣＲＷＮＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ多重ＲＴＰＣＲ双蒸水（无ＲＮＡｓｅ）３２．０２８．０１０×ＰＣＲ缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）５．０５．０ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０５．０ｄＮＴＰｍｉｘ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０４