SNT 2852-2011 大蒜黑腐病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５２—２０１１大蒜黑腐病菌检疫鉴定方法犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犈犿犫犲犾犾犻狊犻犪犪犾犾犻犻（犆犪犿狆犪狀犻犾犲）犛犻犿犿狅狀狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：王英超、姚剑、封立平、魏晓棠、严进、吴兴海、余冬冬、纪瑛、张萍。Ⅰ犛犖／犜２８５２—２０１１大蒜黑腐病菌检疫鉴定方法１　范围本标准规定了进出境植物检疫中大蒜黑腐病菌检疫鉴定方法。本标准适用于进出口大蒜、洋葱以及其他葱属中大蒜黑腐病菌的检疫和鉴定。２　原理２．１　分类学地位大蒜黑腐病菌［犈犿犫犲犾犾犻狊犻犪犪犾犾犻犻（Ｃａｍｐａｎｉｌｅ）Ｓｉｍｍｏｎｓ］属半知菌亚门（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ），丝孢纲（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ），丝孢目（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ），暗色孢科（Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ），埃里砖格孢属（犈犿犫犲犾犾犻狊犻犪）。２．２　鉴定依据大蒜黑腐病菌的形态特征、生物学特性、寄主范围（参见附录Ａ）等是该病菌检疫鉴定方法的依据。３　仪器３．１　生物显微镜（具油镜镜头）、具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于５０Ｘ）。３．２　超净工作台。３．３　电子天平。３．４　光照恒温培养箱。３．５　高压灭菌器。３．６　医用注射器（１０ｍＬ）及针头（１８号）。３．７　血球计数器。４　药品试剂与培养基４．１　蒸馏水。４．２　次氯酸钠或乙醇。４．３　ＰＤＡ培养基。５　现场检疫５．１　直观检查重点检查是否有腐烂、黑色霉状物等病害症状。５．２　症状检查对百合科葱属，尤其是大蒜或洋葱，注意检查蒜瓣或洋葱上是否有形状不规则的黑色凹陷病斑，病斑表面是否有稀疏黑色霉状物，病斑下的组织是否变黑腐，症状图参见附录Ｂ。１犛犖／犜２８５２—２０１１６　实验室检验６．１　分生孢子的直接镜检观察对于有形状不规则的黑色凹陷病斑，病斑表面有稀疏黑色霉状物等症状的大蒜或洋葱，直接挑取症状上的霉状物镜检观察。６．２　病菌的分离和纯化对于症状不明显的葱属植物组织，选取可疑病瓣，用１％次氯酸钠或７５％乙醇表面消毒，用无菌手术解剖刀在患病蒜瓣病健交界处挑取２ｍｍ２×２ｍｍ２病健交界组织若干块，将组织置于无菌平皿中，经１％次氯酸钠或７５％乙醇处理２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，移入无菌水中洗三次，最后接种于ＰＤＡ培养基平板上，每平板接种５点，重复接种三块平板，２５℃左右下培养５ｄ～７ｄ，获得纯培养。随后进行单孢分离，得到单孢菌株，进行形态学鉴定。６．３　致病性测定按照附录Ｃ的方法进行接种试验。７　鉴定特征７．１　培养特征分离菌株在ＰＤＡ培养基上形成灰黑色菌落，平铺，边缘整齐，气生菌丝不发达。７．２　分生孢子特征分生孢子梗粗壮，屈膝状弯曲，有分枝，着生分生孢子的疤痕明显；分生孢子单生，黄褐色，多数椭圆形或近圆柱形、正直，少数弯曲呈Ｓ形或Ｙ形，具有暗褐色横隔４个～１０个，纵隔或斜隔０个～２个，隔膜较厚。孢子大小为２４μｍ～５６μｍ×１０μｍ～１７μｍ，表面光滑或微粗糙。分生孢子图参见附录Ｄ。７．３　致病性测定用分离菌株接种蒜瓣。无伤接种和致伤接种均能致病，表现相同的症状。病菌自大蒜底部的茎盘侵入，蒜瓣基部首先显症。致伤接种的蒜瓣在接种２ｄ后即出现浅黄褐色水浸状病斑，４ｄ后病斑变黑色。此后病斑变黑部分向蒜瓣顶部扩展，表面出现霉状物，蒜肉组织黑腐，腐烂部分逐渐深入。最后整个蒜瓣干缩直至消失殆尽。无伤接种的蒜瓣在接种３ｄ后出现相同症状。致病菌的再分离和鉴定：用接种发病的蒜瓣作常规病组织分离，获得的分离菌与原接种菌形态特征相同。８　结果判定如分生孢子特征、分离物的培养特征、致病性特征及再分离菌株的形状与第７章鉴定特征吻合，鉴定为大蒜黑腐病菌。９　菌种保存分离并最终鉴定为大蒜黑腐病菌的菌株应转接到试管斜面上，置于４℃左右冰箱中保存，并定期（１２０ｄ～１８０ｄ）转管，防止因斜面干燥而造成病原菌死亡。菌株至少需保存６个月。２犛犖／犜２８５２—２０１１附　录　犃（资料性附录）大蒜黑腐病菌相关资料犃．１　学名学名：犈犿犫犲犾犾犻狊犻犪犪犾犾犻犻（Ｃａｍｐａｎｉｌｅ）Ｅ．Ｇ．Ｓｉｍｍｏｎｓ１９７１异名：犎犲犾犿犻狀狋犺狅狊狆狅狉犻狌犿犪犾犾犻犻Ｃａｍｐａｎｉｌｅ１９２４英文名：Ｇａｒｌｉｃｂｕｌｂｃａｎｋｅｒ犃．２　地理分布欧洲：英国、希腊、意大利、罗马尼亚、前南斯拉夫、保加利亚、匈牙利、以色列、西班牙。美洲：美国（马萨诸塞、路易斯安那）、墨西哥、阿根廷、巴西、智利、波多黎各、委内瑞拉。非洲：埃及、南非、津巴布韦。亚洲：韩国、日本、中国（陕西）。大洋洲：澳大利亚、新西兰。犃．３　寄主范围百合科葱属的一些经济作物，主要危害大蒜（犃犾犾犻狌犿狊犪狋犻狏狌犿）和洋葱（犃犾犾犻狌犿犮犲狆犪）。犃．４　传播方式该病害主要在作物病残体、侵染的土壤和受侵染的大蒜中越冬。在潮湿的年份或大蒜储存过程中环境湿度大或大蒜含水量大时，发病较重。３犛犖／犜２８５２—２０１１附　录　犅（资料性附录）大蒜黑腐病菌症状图图犅．１　大蒜黑腐病菌症状图（引自犕犲犾狅犱犻犲犘狌狋狀犪犿）４犛犖／犜２８５２—２０１１附　录　犆（规范性附录）大蒜黑腐病菌菌致病性测定方法及步骤犆．１　接种物准备在ＰＤＡ培养基上培养７ｄ～１０ｄ的菌落上用无菌水收集分生孢子，并配成１０５个／ｍＬ～１０６个／ｍＬ以上的孢子悬浮液。犆．２　接种方法采用无伤接种和致伤接种方法将分离菌回接蒜瓣。无伤接种用分离菌株的孢子悬浮液喷雾接种，致伤接种用针刺法致伤蒜瓣后再喷雾接种。两种方法均以无菌水接种蒜瓣为对照。供试蒜瓣在２５℃，明暗交替各１２ｈ条件下保湿３ｄ后观察。５犛犖／犜２８５２—２０１１附　录　犇（资料性附录）大蒜黑腐病菌分生饱子梗和分生孢子形态特征图图犇．１　大蒜黑腐病菌分生孢子梗和分生孢子形态特征图（引自犅犪狉狉狔犕．犘狉狔狅狉，２００３，横线长度代表３５μ犿）６犛犖／犜２８５２—２０１１书书书１１０２—２５８２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准大蒜黑腐病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ２８５２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数１３千字２０１１年７月第一版　２０１１年７月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１３８　定价１８．００元