SNT 2856-2011 非洲马瘟检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５６—２０１１非洲马瘟检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犃犳狉犻犮犪狀犺狅狉狊犲狊犻犮犽狀犲狊狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（２００８版）中２．５．１章“非洲马瘟诊断技术”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、朱来华、凌宗帅、郑小龙、孙敏、梁成珠、花群义、周晓黎、高志强。　Ⅰ犛犖／犜２８５６—２０１１非洲马瘟检疫技术规范１　范围本标准规定了非洲马瘟的临床诊断要点、非洲马瘟实验室病毒分离技术、反转录聚合酶链式反应技术（ＲＴＰＣＲ）、实时荧光ＲＴＰＣＲ检测技术、ＲＴＰＣＲ分型鉴定技术、血清中和试验（ＳＮＴ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）等实验室操作的技术要求。本标准适用于进出口马、驴、骡等马属动物非洲马瘟的检疫、诊断和血清学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１６５４８　病害动物和病害动物产品生物安全处理规程ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　临床诊断３．１　发病症状首先使个体或群体马保持安静，观察其精神状态、呼吸状况、站立姿势；注意观察头部、颜面及体表是否出现特征性水肿。其次，观察马匹运动状况，是否有行动迟缓、行为异常等现象。在临床诊断观察中应重点注意以下几点：ａ）　马匹表现出严重的呼吸道症状，呼吸频率达６０次／ｍｉｎ甚至７５次／ｍｉｎ，出现不同程度的呼吸困难，在数小时内突然死亡；ｂ）　马匹站立时前腿分开、头向前伸、鼻孔扩大，呈现出痉挛性咳嗽，同时从鼻孔向外流出泡沫样液体；ｃ）　马匹呈现急性发热或弛张型发热，持续１ｄ～２ｄ或５ｄ～８ｄ，最高体温可达４０℃～４１℃；ｄ）　出现特征性水肿，主要表现在颜部、眶上窝和眼睑、嘴唇、面颊、舌部、下颌骨间，有的皮下水肿可扩展到颈部至胸部；ｅ）　结膜和舌腹侧以及皮下有出血点；ｆ）　厌食和精神抑郁，有的烦躁不安，表现出类似疝痛症状。非洲马瘟相关资料参见附录Ａ。３．２　病理变化病理剖检应注意观察以下要点：ａ）　项韧带水肿；ｂ）　畜体肌肉间隙水肿并呈胶冻样；ｃ）　多处组织淤血并形成大量淤斑；１犛犖／犜２８５６—２０１１ｄ）　肺部组织水肿（近一半感染动物出现这一特征）；ｅ）　皮下组织呈现黄色胶冻样水肿；ｆ）　心包积水、体内大量腹水；ｇ）　盲肠和结肠浆膜表面有很多点状出血。４　实验室诊断４．１　病毒分离鉴定注：非洲马瘟病毒分离操作过程应该在具有三级生物安全的实验室内完成。４．１．１　试剂与材料４．１．１．１　Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ２１细胞。４．１．１．２　ＲＰＭＩ１６４０培养基或其他等效培养基。４．１．１．３　胎牛血清。４．１．１．４　青霉素、链霉素。４．１．１．５　肝素。４．１．１．６　各种常规试剂及细胞培养相关耗材。４．１．２　设备４．１．２．１　超净工作台或生物安全柜。４．１．２．２　高速冷冻离心机。４．１．２．３　倒置光学显微镜。４．１．２．４　二氧化碳细胞培养箱。４．１．２．５　高压灭菌锅。４．１．３　样品采集４．１．３．１　血液样品颈静脉无菌采集动物的肝素抗凝血，置－２０℃保存备用。４．１．３．２　组织样品无菌采集动物的脾、肺、淋巴结等组织，保温盒加冰冷藏保存，迅速送往指定的实验室。若需长期保存，置－７０℃。４．１．４　组织样品的前处理取采集的组织２ｇ～４ｇ，以ｐＨ７．２的ＰＢＳ液将其研磨成１０％的悬液。悬液中加入青霉素（终浓度为１００ＩＵ／ｍＬ）、链霉素（终浓度为１００μｇ／ｍＬ），１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收取上清液－５℃～－３０℃保存备用。４．１．５　病毒增殖４．１．５．１　血样培养状态良好的Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ２１细胞。无菌抗凝血样勿需稀释可直接用于接种细胞：取适量血样样品接种单层细胞，３７℃吸附６０ｍｉｎ。充分洗涤后加维持液，置３７℃５％二氧化碳培养箱培养。血液样品也可先用ｐＨ７．２的ＰＢＳ液或细胞培养液洗涤两次，然后反复冻融（充分裂解，以排除血２犛犖／犜２８５６—２０１１液中可能含有的抗体对游离病毒的中和，同时促进病毒从红细胞中大量释放）。用含抗生素的ＰＢＳ液对裂解的血样做１∶１０稀释，接种单层细胞进行病毒增殖。２４ｈ后逐日观察细胞病变（ＣＰＥ），连续观察８ｄ。４．１．５．２　组织样品培养状态良好的Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ２１细胞。取适量预先处理好的组织悬液，无菌接种到生长良好的细胞单层，３７℃吸附６０ｍｉｎ后加细胞维持液，置３７℃含５％二氧化碳培养箱，２４ｈ后逐日观察ＣＰＥ情况，连续观察１０ｄ。１０ｄ后无细胞病变的样品继续盲传２代，仍无ＣＰＥ的则判为ＡＨＳＶ阴性。阳性病料一般会在接种后２ｄ～８ｄ内出现ＣＰＥ，待８０％细胞出现ＣＰＥ时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融３次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心收取上清液，等量分装后保存（－５℃～－３０℃），待进一步鉴定。４．１．５．３　乳鼠接种选择１０只１ｄ～３ｄ龄健康乳鼠，每只乳鼠脑内接种２０μＬ组织悬液。阳性病料一般在接种３ｄ～１５ｄ后，乳鼠可表现出神经症状。取发病鼠脑，匀浆处理，脑内接种８只乳鼠。第二次传代后乳鼠会在２ｄ～５ｄ内发病，感染率为１００％。收集发病鼠脑，匀浆后以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液等量分装后保存（－５℃～－３０℃），待进一步鉴定。４．１．６　病毒分离鉴定分离的细胞毒或乳鼠脑毒可采用ＥＬＩＳＡ病原检测、反转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）、荧光ＰＣＲ检测技术等进行非洲马瘟病毒及病毒血清型鉴定。４．２　酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）注：该方法为双抗夹心ＥＬＩＳＡ抗原检测，可对疫区或周边地区非洲马瘟的传播媒介（昆虫）以及非洲马瘟病毒的宿主（马属动物）进行流行病学的病原调查，特别适用于非洲马瘟疾病的早期诊断。４．２．１　试剂与材料４．２．１．１　０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．６碳酸钠／碳酸氢钠缓冲液（包被液）。４．２．１．２　酶标抗体（兔抗豚鼠ｌｇＧ辣根过氧化物酶结合物）。４．２．１．３　标准阳性抗原（指定单位提供）。４．２．１．４　标准阴性对照（指定单位提供）。４．２．１．５　捕获抗体（指定单位提供）。４．２．１．６　豚鼠抗血清（指定单位提供）。４．２．１．７　０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４的ＰＢＳ液。４．２．１．８　吐温２０。４．２．１．９　脱脂奶粉。４．２．１．１０　１ｍｏｌ／Ｌ硫酸。４．２．１．１１　９６孔酶标板。４．２．２　设备４．２．２．１　酶标仪。４．２．２．２　洗板机。４．２．２．３　恒温振荡培养箱。３犛犖／犜２８５６—２０１１４．２．２．４　各种规格微量移液器。４．２．２．５　各种ＥＬＩＳＡ试验用相关耗材。４．２．３　操作步骤４．２．３．１　固相包被将预先滴定好的兔抗血清（捕获抗体）用包被液稀释到工作浓度，每孔５０μＬ包被９６孔板，置湿盒内室温过夜孵育。４．２．３．２　洗板以ｐＨ７．４的０．０５％ＰＢＳＴ洗板５次，最后一次要充分吸去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）。４．２．３．３　封闭以含有５％（质量浓度）脱脂奶粉的ＰＢＳＴ（封闭液）对包被板进行封闭，每孔加１００μＬ，置３７℃温箱内，振荡孵育１ｈ（１５０ｒ／ｍｉｎ）。４．２．３．４　加检测样品洗板后，在预先设置好的板孔分别加１００μＬ稀释度为１∶１２８待测样品。试验同时设立重复孔的阳性抗原和阴性抗原对照。然后放置３７℃温箱，振荡孵育１ｈ。４．２．３．５　加豚鼠抗血清洗板后，以０．０５％ＰＢＳＴ将预先滴定好的豚鼠抗血清稀释到工作浓度，每孔加５０μＬ，置３７℃，振荡孵育１ｈ（１５０ｒ／ｍｉｎ）。４．２．３．６　加酶标抗体洗板后，以ＰＢＳＴ将预先滴定好的酶标抗体稀释到工作浓度，每孔５０μＬ。置３７℃振荡孵育１ｈ。４．２．３．７　显色反应充分洗板后，每孔加５０μＬ新鲜制备的含有０．０５％Ｈ２Ｏ２（３０％体积分数）的ＯＰＤ底物溶液（浓度为０．４ｍｇ／ｍＬ），置避光处１５ｍｉｎ。按加底物的顺序每孔加５０μＬ终止液，１０ｍｉｎ内读板。４．２．３．８　读板以４９２ｎｍ波长测定吸光值，记录结果。４．２．４　结果判定如果检测样品的吸光值低于０．１，判为ＡＨＳＶ阴性。如果检测样品的吸光值高于０．１５，判为ＡＨＳＶ阳性。如果检测样品的吸光值介于０．１和０．１５之间则判为可疑。可疑样品需重复检测，重复仍然可疑，判定为ＡＨＳＶ阳性。４．３　反转录聚合酶链式反应检测技术（犚犜犘犆犚）４．３．１　试剂与材料４．３．１．１　ＯｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲｋｉｔ（犙犻犪犵犲狀公司）：包含ＲＴ和ＰＣＲ酶，ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ缓冲液，氯化４犛犖／犜２８５６—２０１１镁等ＰＣＲ反应核心试剂。也可选用等效的其他商业化试剂盒。４．３．１．２　ＲＮＡ酶抑制剂。４．３．１．３　ＴＡＥ电泳液。４．３．１．４　ＤＥＰＣ（焦碳酸二乙酯）。４．３．１．５　琼脂糖。４．３．１．６　ＥＢ染色液。４．３．１．７　ＤＮＡ低相对分子质量Ｍａｒｋｅｒ。４．３．１．８　各种分子生物学试验常用分析纯试剂。４．３．１．９　引物上游引物ｐｒｉｍｅｒ１（２０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’ＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＴＧＴ３’下游引物ｐｒｉｍｅｒ２（２０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’ＧＧＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＧＧＣＴＧＣＡＴＡ３’４．３．２　设备４．３．２．１　高速冷冻离心机。４．３．２．２　各种规格移液器。４．３．２．３　普通ＰＣＲ仪。４．３．２．４　凝胶成像系统。４．３．２．５　电泳仪。４．３．３　病毒犱狊犚犖犃提取对采集的抗凝血、病料组织匀浆液、病毒细胞培养物等待检测样品，可使用商业化的ＲＮＡ提取试剂盒（如：选用Ｒｏｃｈｅ公司的ＨｉｇｈＰｕｒｅｖｉｒａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＫｉｔ），按照试剂盒使用说明书的步骤提取非洲马瘟病毒ｄｓＲＮＡ。采用相同的方法对非洲马瘟病毒阳性病料组织，非洲马瘟病毒阴性组织样品提取核酸，分别作为ＲＴＰＣＲ反应的阴、阳性对照模板。４．３．４　操作步骤注：以下操作按照ｏｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲｋｉｔ提供说明书的要求完成。４．３．４．１　犱狊犚犖犃变性对每一检测样品准备如下反应混合液（１０μＬ）：上游引物（０．５μＬ）；下游引物（０．５μＬ）；无核酸酶的灭菌水（７μＬ）；ＲＮＡ模板（２μＬ）。将反应管放置在热循环仪上，９５℃５ｍｉｎ，稍做离心后迅速将管放置在冰上。４．３．４．２　准备犚犜犘犆犚反应液取一洁净１．５ｍＬ离心管，根据检测样品的数量（含对照品）准备ＲＴＰＣＲ的反应液，其中每１５μＬ的ＰＣＲ混合液中包含：无核酸酶的灭菌水（３．２５μＬ）；５×ＰＣＲ缓冲液（５μＬ）；１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合液（０．５μＬ）；５×Ｑ液５μＬ；ＲＮＡ抑制剂（０．２５μＬ，２０Ｕ／μＬ），酶混合液（１μＬ）。取１５μＬＲＴＰＣＲ反应混合液与４．３．４．１预变性处理的１０μＬ预变性ＲＮＡ模板溶液混合。每次ＲＴＰＣＲ检测反应，都应设置阳性对照（２μＬＡＨＳＶＲＮＡ作模板）和阴性对照（２μＬ灭菌水代替ＲＮＡ模板）。４．３．４．３　犚犜犘犆犚反应将反应管置ＰＣＲ仪，依次设置如下热循环参数后运行ＰＣＲ程序。５犛犖／犜２８５６—２０１１５５℃３０ｍｉｎ；９５℃１５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，４０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。４．３．４．４　电泳ＰＣＲ运行结束后，取出ＰＣＲ反应管，在内加２．５μＬ１０×载样缓冲液后，将样品置于以ＴＡＥ配制的３％的琼脂糖凝